Nghiên cứu sử dụng Enzyme Phytase để nâng cao giá trị dinh dưỡng khoáng trong sữa yến mạch thanh trùng pasteur

Nội dung text: Nghiên cứu sử dụng Enzyme Phytase để nâng cao giá trị dinh dưỡng khoáng trong sữa yến mạch thanh trùng pasteur

1. HNUE JOURNAL OF SCIENCE DOI: 10.18173/2354-1059.2020-0013 Natural Sciences, 2020, Volume 65, Issue 3, pp. 107-116 This paper is available online at NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ENZYME PHYTASE ĐỂ NÂNG CAO GIÁ TRỊ DINH DƯỠNG KHỐNG TRONG SỮA YẾN MẠCH THANH TRÙNG PASTEUR Trần Thị Thúy và Lê Thị Hồng Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Tĩm tắt. Sữa yến mạch là sản phẩm giàu dinh dưỡng, được các nước châu Âu sử dụng để bồi bổ sức khỏe cho mọi lứa tuổi. Tuy nhiên, hàm lượng chất kháng dinh dưỡng phytate trong hạt yến mạch cũng khá cao (1 - 3% hàm lượng chất khơ của hạt), phytate tạo phức chất khĩ tan với các ion kim loại thiết yếu trong sữa yến mạch, do vậy làm giảm hiệu quả hấp thu khống trong sữa. Trong nghiên cứu này, chúng tơi đã lựa chọn được enzyme phytase BacP (hàm lượng 40IU/l) để xử lí sữa yến mạch sau khi thanh trùng Pasteur để giải phĩng 20-30% hàm lượng phốt pho vơ cơ từ phytate trong sữa, làm tăng hàm lượng các khống dễ tiêu (Ca2+: 27,0%; Fe2+: 49,3%, Zn2+: 63,3% và Mg2+: 95,6%) so với sữa khơng được xử lí enzyme. Nghiên cứu này gĩp phần chứng minh vai trị của enzyme phytase trong việc xử lí sữa yến mạch, làm giảm hàm lượng chất kháng dinh dưỡng phytate, tăng giá trị dinh dưỡng khống trong sữa. Từ khĩa: hấp thu khống, phytase, phytate, phốt phát vơ cơ, sữa yến mạch. 1. Mở đầu Yến mạch và các sản phẩm từ yến mạch như: sữa yến mạch, cháo yến mạch, bột dinh dưỡng yến mạch là loại thực phẩm giàu dinh dưỡng cĩ hàm lượng chất xơ hịa tan (β - glucan) cao; các nguyên tố khống vi lượng (Ca, Mn, K, Na, Mg, P, Cu ) đầy đủ. Ngồi ra, các sản phẩm từ yến mạch cịn chứa các axit béo (Omega-3, Omega-6, ) rất tốt cho sức khỏe, tăng cường trí lực; các vitamin thiết yếu (B6, B12), cung cấp choline và đặc biệt là folate, rất cần thiết cho phụ nữ mang thai [1]. Sữa yến mạch cũng khơng chứa sterol, yếu tố gây mắc bệnh tim mạch. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng sử dụng các sản phẩm từ yến mạch làm giảm lượng cholesterol trong máu từ đĩ làm giảm nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch [2]. Tuy nhiên, hàm lượng chất kháng dinh dưỡng phytate (myo-inositol hexakisphosphate) trong hạt yến mạch lại khá cao (1 - 3% hàm lượng chất khơ của hạt) [3]. Chúng là nguồn dự trữ phốt phát chủ yếu trong hạt, chiếm hơn 80% tổng số phốt pho cĩ trong hạt [4]. Phytate trong thực vật thường ở dạng muối của axit phytic liên kết chặt chẽ với các nguyên tố khống như: Ca, Mg, Fe và Zn, [5, 6]; ngồi ra chúng cũng liên kết với các axit amin, và các protein, làm hạn chế quá trình tiêu hĩa và hấp thu dinh dưỡng khống và protein từ thức ăn [3]. Do vậy, phytate được coi như một yếu tố kháng dinh dưỡng trong thực phẩm cĩ nguồn gốc từ thực vật. Loại bỏ phytate trong sữa yến mạch là việc làm cần thiết nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng của sản phẩm này. Phytase là enzyme thủy phân đặc hiệu đối với cơ chất phytate, được ứng dụng phổ biến Ngày nhận bài: 15/3/2020. Ngày sửa bài: 23/3/2020. Ngày nhận đăng: 30/3/2020. Tác giả liên hệ: Trần Thị Thúy. Địa chỉ e-mail: thuy_tt@hnue.edu.vn 107
2. Trần Thị Thúy và Lê Thị Hồng trong chế biến thức ăn chăn nuơi và thực phẩm để loại bỏ chất kháng dinh dưỡng phytate, tăng hàm lượng phốt phát cũng như các khống chất dễ tiêu trong thực phẩm và thức ăn chăn nuơi. Loại bỏ phytate trong sữa đậu nành bằng cách bổ sung trực tiếp phytase từ lúa mì đã được Anno và cs tiến hành từ những năm 1985 [7]. Năm 1990, Simell và cs đã sử dụng Finase S, một phytase thương phẩm tách chiết từ Aspergillus awamori, để tạo ra loại protein đậu nành khơng chứa phytate [8]. Năm 2006 Greiner và Konietzny đã đề xuất việc sử dụng phytase hoặc các vi sinh vật sinh phytase (nấm men, vi khuẩn lactic) trong quá trình làm bánh mì, lên men thực phẩm để làm giảm hàm lượng phytate trong thực phẩm. Bổ sung phytase trong quá trình làm bánh mì khơng chỉ làm giảm hàm lượng phytate mà cịn giúp giải phĩng canxi từ phức chất IP6 -Ca cần cho hoạt động của α-amylase, do đĩ gián tiếp giúp cải thiện chất lượng bánh m [9]. Nghiên cứu này gĩp phần chứng minh vai trị của enzyme phytase trong việc loại bỏ chất kháng dinh dưỡng phytate trong sữa yến mạch, giúp giải phĩng phốt phát vơ cơ (Pvc) và các cation kim loại dễ tiêu trong sữa, gĩp phần nâng cao giá trị dinh dưỡng khống cho sữa yến mạch. 2. Nội dung nghiên cứu 2.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Nguyên vật liệu Enzyme phytase BacP, được sản xuất từ chủng Bacillus sp. MD2, do Bộ mơn Cơng nghệ sinh học – Vi sinh, trường Đại học Sư phạm Hà Nội cung cấp; Enzyme phytase EcoP, cĩ nguồn gốc từ Escherichia coli, do cơng ty OptiPhos (JBS United, Indiana, Mỹ) sản xuất. Hạt yến mạch nguyên cám của cơng ty Johnny’s Selected Seeds (Mỹ), được sử dụng để sản xuất sữa yến mạch trong phịng thí nghiệm. Các hĩa chất phân tích: Natri-phytate (Sigma, P3168), ammonium molypdate (Merck), tricloroaxetic acid (TCA - Trung Quốc); dung dịch chuẩn 1000 ppm Fe2+, Mg2+, Zn2+ và Ca2+ (Scharlau, Tây Ban Nha); và các hĩa chất thơng dụng khác được mua của Trung Quốc và Việt Nam: CH3COOH, FeSO4.7H2O, CH3COONa, NaOH, HCl, Na2CO3, C2H5OH, NH4OH đều đạt độ tinh sạch ở mức phân tích. 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu * Chế biến sữa yến mạch Hạt yến mạch (20 g) được ngâm trong nước khử ion ở 30 ºC trong 5 giờ. Sau đĩ, bổ sung nước khử ion ở 80 ºC vào các mẫu này cho đạt thể tích 200 ml và nghiền bằng máy nghiền đồng thể, lọc qua vải bơng loại bỏ cặn thu được sữa yến mạch thơ. Sữa yến mạch thơ được thanh trùng Pasteur ở 90 - 95 ºC trong 10 phút, sau đĩ được làm nguội đến nhiệt độ phịng và bảo quản ở 10 ºC trong 7 - 10 ngày. * Xác định hàm lượng phytate trong sữa yến mạch Căn cứ vào đặc tính kết tủa mạnh của phytate với ion Fe3+, người ta cho một lượng dư Fe3+ vào sữa yến mạch để kết tủa tồn bộ phytate trong sữa. Sau đĩ, rửa sạch Fe3+ dư trong kết tủa Fe-phytate và xác định hàm lượng sắt cĩ trong kết tủa. Từ hàm lượng sắt cĩ trong kết tủa với phytate, ta cĩ thể tính được hàm lượng của phytate trong sữa theo nguyên tắc: Một phân tử phytate liên kết với 4 phân tử sắt và khối lượng của phytate gấp 2,98 lần khối lượng của sắt [10]. Sữa yến mạch được dùng để kết tủa phytate là sữa được chế biến cơ đặc 2 lần (200 g hạt yến mạch cho 1 lit sữa). mphytate trong sữa = 2,98 × mFe trong kết tủa Fe-phytate Hàm lượng Fe3+đã kết tủa với phytate được xác định bằng máy phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử NOVAA 350 (AnalytikJena, Đức), dựa trên đồ thị chuẩn tương quan giữa giá trị phổ 108
3. Nghiên cứu sử dụng enzyme phytase để nâng cao giá trị dinh dưỡng khống trong sữa yến mạch 3+ hấp thụ nguyên tử ở bước sĩng 248,33 nm (A248,33) và nồng độ Fe trong dung dịch chuẩn (nồng độ: 0; 0,5; 1; 2; 3; 4 và 4,5 ppm pha bằng dung dịch đệm 1% HNO3). * Xác định hàm lượng protein tổng số trong sữa yến mạch Pha lỗng sữa yến mạch đến nồng độ thích hợp và tiến hành phản ứng mầu với dung dịch Coomasie blue theo phương pháp Bradford [11] và đo quang phổ hấp phụ ánh sáng ở bước sĩng 595nm. Tính tốn hàm lượng protein theo phương trình đường chuẩn tương quan giữa hàm lượng BSA (Bovin Serum Albumin- Albumin huyết thanh bị) cĩ nồng độ chuẩn 0, 2,5; 5; 10; 15; 20; 25 và 30 μg/ml với độ hấp phụ quang ở bước sĩng 595nm (A595) trên máy đo quang phổ (UV-VIS – 1240 Shimadzu, Nhật). * Xác định hoạt tính enzyme phytase [12] Enzyme phytase BacP được pha trong dung dịch đệm 0,1 M Tris- HCl, pH = 7 cĩ bổ sung 5 mM CaCl2; enzyme phytase EcoP được pha trong dung dịch đệm 0,1 M CH3COONa, pH = 5,5 chứa 1 mM CaCl2. Enzyme được pha lỗng đến nồng độ thích hợp và được phản ứng với dung dịch cơ chất (1,67 mM Natri-phytate) theo tỷ lệ 1:9 về thể tích. Phản ứng enzyme được diễn ra trong 10 phút ở nhiệt độ 55ºC (đối với EcoP) và 70ºC (đối với BacP) và dừng phản ứng bằng cách bổ sung 1 thể tích tương ứng dung dịch TCA 15% (Tri-chloro acetic acid). Sau đĩ dịch phản ứng được li tâm, thu dịch nổi và bổ sung dung dịch màu (chứa 4 lần thể tích dung dịch A (1,5% amoniummolypdate (NH4)6Mo7O24) trong 5,5% H2SO4) và 1 lần thể tích dung dịch B (2,7% FeSO4.7H2O)) theo tỷ lệ 1:1 về thể tích và đo độ hấp thụ quang ở bước sĩng 700nm. Phản ứng đối chứng âm (khơng chứa enzyme) được tiến hành tương tự nhưng dung dịch TCA 15% được bổ sung trước khi bổ sung dung dịch cơ chất. Hàm lượng phốt phát vơ cơ (Pvc) được giải phĩng từ phản ứng enzyme được tính tốn dựa vào đồ thị tương quan giữa nồng độ Pvc chuẩn 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,5 và 0,6 mM của dung dịch NaH2PO4 với độ hấp thụ quang ở bước sĩng 700nm (A700) trên máy đo quang phổ (UV-VIS - 1240 Shimadzu, Nhật). Một đơn vị hoạt tính (IU) được quy định là lượng enzyme để giải phĩng 1 µmol Pvc trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm [12]. * Xác định động thái hoạt động của enzyme phytase trên cơ chất natri-phytate Enzyme BacP hoặc EcoP được pha lỗng đến nồng độ thích hợp bằng dung dịch đệm, sau đĩ, bổ sung 0,15 ml enzyme vào 30 ml dung dịch cơ chất (10 mM natri-phytate) cho đạt nồng độ enzyme 20 - 40 IU/l. Thí nghiệm được tiến hành trong bể ổn nhiệt ở 70 oC (đối với enzyme phytase BacP) và bể ổn nhiệt 55 oC (đối với enzyme phytase EcoP). Mẫu được lấy ra từ phản ứng tại các thời điểm xác định, được bổ sung một thể tích tương ứng dung dịch 15% TCA để dừng phản ứng, xử lí mẫu và tiến hành phản ứng màu như thí nghiệm xác định hoạt tính phytase. Lượng Pvc tạo ra được xác định dựa trên đồ thị chuẩn Pvc (nêu trên). * Xác định động thái hoạt động của enzyme phytase trên cơ chất sữa yến mạch Tiến hành tương tự như phương pháp xác định động thái enzyme trên cơ chất phytate chuẩn nhưng dung dịch cơ chất chuẩn được thay bằng sữa yến mạch thơ (chưa qua thanh trùng Pasteur). * Xác định hàm lượng kim loại hịa tan được giải phĩng trong quá trình xử lí sữa yến mạch bằng enzyme phytase Mẫu sữa dùng để xác định hàm lượng Fe2+, Mg2+, Ca2+ được xử lí bằng dung dịch 2% 2+ HNO3, cịn mẫu dùng để xác định Zn được xử lí bằng dung dịch 1% HCl theo tỷ lệ thể tích 1:1 để nồng độ HNO3 hoặc HCl của dung dịch sau cùng trước khi đi phân tích lần lượt là 1% và 0,5 %. Tiếp tục li tâm dịch sữa yến mạch 8000 vịng/phút trong 5 phút để thu dịch nổi, các mẫu dịch nổi được lọc lại một lần nữa bằng giấy lọc trước khi bảo quản trong điều kiện - 20oC. Xác định hàm lượng các kim loại cĩ trong dung dịch bằng máy phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử NOVAA 350 (Analytik Jena, Đức) ở bước sĩng tương ứng với từng kim loại: đo Zn2+ ở bước 109
4. Trần Thị Thúy và Lê Thị Hồng sĩng 213,86 nm, đo Mg2+ ở bước sĩng 285,51 nm, đo Ca2+ ở bước sĩng 422,7 nm, đo Fe2+ ở bước sĩng 248,33 nm [13]. Hàm lượng kim loại trong các mẫu sữa yến mạch được xác định dựa vào đồ thị tương quan giữa nồng độ chuẩn các ion kim loại (0 – 10ppm) với độ hấp thu quang ở bước sĩng tương ứng với từng kim loại. * Phân tích các kết quả thí nghiệm Các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần, kết quả thí nghiệm được tính giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. 2.2. Kết quả và thảo luận 2.2.1. Đánh giá một số giá trị dinh dưỡng chính trong sữa yến mạch * Hàm lượng phytate trong sữa yến mạch Hàm lượng sắt trong kết tủa sắt-phytate trong mẫu sữa yến mạch thu được là 632,322 μg/ml, tương ứng với 0,942 mg/ml phytate trong sữa yến mạch. Theo kết quả này thì: lượng Pvc cĩ thể giải phĩng ra sau khi phân giải triệt để phytate trong sữa là 8,5651 mM. Kết quả này tương đồng với báo cáo của Hídvégi và cs (2002), theo đĩ, hàm lượng phytate cĩ trong 100 g yến mạch khoảng 0,90 - 1,42 g [14]. * Hàm lượng protein trong sữa yến mạch Kết quả xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford cho thấy: trong 100 ml sữa yến mạch cĩ 1,85 g protein. Theo báo cáo của Bộ Nơng nghiệp Hoa Kì thì hàm lượng protein cĩ trong 100 g hạt yến mạch là 17 g [15]. Như vậy, so với một số loại ngũ cốc thì hàm lượng protein trong hạt hạt yến mạch là cao hơn (hàm lượng protein trong lúa gạo là 7,9 %, lúa mì là 16,8 %, ngơ 10,6 %, cao lương 12,7 %, kê 11,3% tính theo hàm lượng chất khơ) nhưng lại thấp hơn hẳn so với hạt đậu nành (37%) [16]. 2.2.2. Lựa chọn enzyme phytase để phân giải phytate trong sữa Hai loại phytase chính là phytase axit (EcoP) cĩ nguồn gốc từ E. coli và phytase kiềm (BacP) cĩ nguồn gốc từ Bacillus subtilis MD2 được đánh giá trên cơ chất chuẩn (natri-phytate) trong dung dịch đệm và cơ chất phytate trong sữa yến mạch. Hoạt tính của chế phẩm enzyme BacP được xác định là: 263,5483 (IU/ml) và của chế phẩm enzyme EcoP là: 57,4549 (IU/ml). Các dịch enzyme phytase này được pha lỗng đến nồng độ thích hợp bằng dung dịch đệm trước khi tiến hành các thí nghiệm. 100 80 60 BacP 40 EcoP giải phĩng (%) phĩng giải 20 vc P 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Thời gian (phút) Hình 1. Khả năng xúc tác giải phĩng Pvc của EcoP và BacP trên cơ chất natri-phytate Đánh giá trên dung dịch cơ chất chuẩn (10 mM natri-phytate) EcoP hoạt động tốt ở 55 ºC trong điều kiện axit (pH 5,5), xúc tác phân giải cơ chất natri-phytate rất hiệu quả, giải phĩng tới 92,14% lượng Pvc sẵn cĩ trong 10 mM natri-phytate sau 25 giờ phản ứng (Hình 1). Trong khi 110
5. Nghiên cứu sử dụng enzyme phytase để nâng cao giá trị dinh dưỡng khống trong sữa yến mạch đĩ, enzyme BacP hoạt động tốt ở 70 ºC trong điều kiện trung tính, hơi kiềm (pH 7) [17], xúc tác phân giải cơ chất natri-phytate chuẩn chậm hơn, chỉ giải phĩng được 64,33% lượng Pvc sẵn cĩ trong 10 mM natri-phytate sau 52 giờ phản ứng (Hình 1). Kết quả này là hồn tồn phù hợp với các nghiên cứu về cơ chế hoạt động của phytase kiềm và axit [18]. Theo đĩ, phytase axit (EcoP) hoạt động trong mơi trường axit, thủy phân phytate, giải phĩng 5 - 6 gốc Pvc, tạo ra sản phẩm cuối cùng là IP1 hoặc inositol; cịn phytase kiềm (BacP) hoạt động trong mơi trường trung tính, hơi kiềm, thủy phân phytate và chỉ giải phĩng 3 - 4 gốc Pvc, tạo ra sản phẩm cuối cùng là IP3, IP2. Đối với cơ chất phytate trong sữa yến mạch, sự xúc tác thủy phân phytate giải phĩng Pvc của hai enzyme này tương đối khác nhau về thời gian. Sau 5 giờ phản ứng ở 55 ºC, EcoP xúc tác giải phĩng được lượng Pvc cực đại, đạt 83,88% lượng Pvc tổng số của phytate cĩ trong sữa yến mạch; trong khi enzyme BacP chỉ xúc tác giải phĩng được lượng Pvc cực đại là 39,29% từ phytate cĩ trong sữa yến mạch, ở 70ºC (Hình 2). Mặc dù pH của dịch sữa yến mạch thơ cũng ở điều kiện trung tính nhưng rõ ràng là các yếu tố khác (hàm lượng tinh bột, khống ) trong sữa yến mạch đã hạn chế hoạt động của enzyme BacP. 100 90 80 70 60 50 EcoP 40 giải phĩng (%) phĩng giải BacP 30 vc P 20 10 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Thời gian (phút) Hình 2. Khả năng xúc tác giải phĩng Pvc của EcoP và BacP trên cơ chất sữa yến mạch IP6 và IP5 được cho là cĩ ái lực cao với protein và các cation kim loại nên làm giảm khả năng hấp thụ các nguyên tố khống và các loại protein. IP1 chưa được báo cáo cĩ giá trị gì trong quá trình chuyển hĩa các chất trong cơ thể nhưng IP2, IP3 và IP4 được báo cáo cĩ vai trị nịng cốt trong việc truyền tín hiệu qua màng và huy động nguồn canxi dự trữ trong tế bào [3]. Các dẫn xuất IP2, IP3, IP4 này lại ít cĩ ái lực với các cation kim loại và các protein nên khơng ngăn cản khả năng hấp thụ khống và protein của cơ thể người và động vật. Một số đồng phân hình học của IP3 được sử dụng để phịng tránh viêm khớp, bệnh hen, hoặc làm thuốc giảm đau [19]. Ester của inositol triphosphate được sử dụng làm chất ức chế chống lại sự lây nhiễm các bệnh do nhĩm retrovirus gây ra bao gồm cả HIV [20]. Chính vì vậy để loại bỏ tính kháng dinh dưỡng của phytate nhưng vẫn thu được hàm lượng IP2, IP3, IP4 cao nhất thì lượng Pvc được giải phĩng nên trong khoảng 20% - 50% tổng lượng phốt pho cĩ trong phytate. Vì những lí do vừa đề cập ở trên mà chúng tơi lựa chọn enzyme phytase BacP để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo trên cơ chất sữa yến mạch. 2.2.3. Lựa chọn nồng độ enzyme BacP để xử lí phytate trong sữa yến mạch ở điều kiện bảo quản Tận dụng thời gian bảo quản sữa (từ khi xuất xưởng đến khi đến tay người sử dụng) ở 4 - 10 ºC cho hoạt động của enzyme phytase phân giải phytate trong sữa yến mạch là một cách thức tiết kiệm thời gian và chi phí cho quy trình sản xuất sữa yến mạch thanh trùng. Trong các thí nghiệm trước đây (kết quả khơng cơng bố trong bài báo này), chúng tơi đã xác định được thời 111
6. Trần Thị Thúy và Lê Thị Hồng gian bảo quản sữa yến mạch ở nhiệt độ mát (10ºC) là 7 - 10 ngày, do vậy các thí nghiệm xử lí phytase BacP trên cơ chất sữa yến mạch được tiến hành ở 10 ºC trong 7 ngày. Trên cơ chất sữa yến mạch, ở nhiệt độ bảo quản (10 ºC), khả năng phân giải phytate của BacP là tương đối thấp và giống nhau ở các nồng độ enzyme từ 43,9 đến 527,1 IU/l (Hình 3). Kết quả này tương đồng với kết quả ở thí nghiệm xác định khả năng phân giải phytate trong sữa yến mạch ở 70 oC với thời gian ngắn hơn (Hình 2). Do vậy, nồng độ enzyme phytase BacP 43,9 IU/l cĩ thể được lựa chọn để xử lí phytate trong quá trình bảo quản sữa yến mạchbởi các lí do sau: (1) hàm lượng Pvc được giải phĩng từ ngày thứ 4 tới ngày thứ 7 nằm trong khoảng 20 - 50% tổng lượng Pvc cĩ thể giải phĩng, tương ứng với lượng dẫn xuất cĩ ích IP2, IP3 và IP4 tạo ra nhiều nhất; (2) hàm lượng enzyme phytase BacP sử dụng ít, tiết kiệm chi phí cho enzyme. Hình 3. Hoạt động của phytase BacP (ở các nồng độ khác nhau) trên cơ chất sữa yến mạch bảo quản ở nhiệt độ 10⁰C 2.2.4. Xử lí phytate trong sữa yến mạch thơ bằng enzyme BacP trong quy trình sản xuất sữa thanh trùng Phytate trong sữa yến mạch thơ cũng cĩ thể được xử lí trước khi thanh trùng sữa hoặc ngay sau quá trình thanh trùng sữa để tận dụng nhiệt độ của giai đoạn thanh trùng vì nhiệt độ thanh trùng sữa thường là 90 - 95 ºC và enzyme phytase BacP cĩ thể hoạt động tốt ở nhiệt độ 70 - 75 ºC [21]. Thử nghiệm xử lí phytate trong sữa yến mạch bằng enzyme phytase BacP (nồng độ 43,9 IU/l ở: (1) nhiệt độ phịng trong 30 phút trước khi thanh trùng; (2) 70 ºC trong 10 phút sau thanh trùng; (3) 70 ºC trong 20 phút sau thanh trùng và (4) bổ sung enzyme 43,9 IU/l ngay sau khi thanh trùng sữa ở 90ºC cho thấy: sự khác biệt khơng lớn về hàm lượng Pvc giải phĩng (nằm trong khoảng 20 - 30 % tổng lượng Pvc cĩ trong phytate của sữa yến mạch), kể cả trong thời gian bảo quản sữa yến mạch thanh trùng (ở 10 ºC trong 7 ngày). Như vậy, các phương án trên đều cĩ thể được lựa chọn để xử lí phytate trong sữa yến mạch thanh trùng. Phương án bổ sung enzyme ngay sau quá trình thanh trùng là phương án khả thi nhất bởi nhiệt độ cao ngay sau thời gian thanh trùng sẽ làm giảm thiểu tối đa khả năng nhiễm khuẩn cho sữa yến mạch thành phẩm. Theo dõi quá trình giải phĩng Pvc trong 40 - 60 phút ở các điều kiện nhiệt độ và nồng độ enzyme BacP khác nhau trong cùng thể tích 30ml sữa yến mạch thanh trùng, chúng tơi nhận thấy: (1) Khi bổ sung enzyme và giữ trong khoảng nhiệt độ 50 - 65ºC trong 30 - 60 phút sẽ gây ra hiện tượng chín tinh bột và kết lắng dưới đáy bình, làm cho sữa khơng đồng nhất, giảm cảm quan cho sữa yến mạch; (2) Nồng độ enzyme 30 IU/l là quá thấp để đạt được hàm lượng Pvc giải phĩng nằm trong khoảng 20 - 30 % lượng phốt phát dự trữ trong phytate của sữa yến mạch; (3) Các phương án bổ sung enzyme từ 40 - 45 IU/l đều cĩ thể được sử dụng khi xử lí trên 40 phút ở 112
7. Nghiên cứu sử dụng enzyme phytase để nâng cao giá trị dinh dưỡng khống trong sữa yến mạch 30ºC và trên 20 phút ở trường hợp xử lí sữa yến mạch ở 80ºC cho tự giảm xuống nhiệt độ phịng. Các thí nghiệm này (Bảng 1) đều cho kết quả đạt yêu cầu đề ra về hàm lượng Pvc giải phĩng (nằm trong khoảng 20 - 30 % lượng phốt phát dự trữ trong phytate của sữa yến mạch). Bảng 1. Tỉ lệ Pvc giải phĩng (%) so với lượng Pvc vốn cĩ của phytate trong sữa yến mạch khi xử lí sữa yến mạch thơ bằng enzyme BacP ở các nồng độ, nhiệt độ và thời gian khác nhau Nhiệt độ (oC) Thời gian Nồng độ BacP (IU/l) (phút) 30 40 45 30 40 15,403 ± 0,51 19,903 ± 0,92 20,073 ± 0,67 60 16,817 ± 0,67 20,975 ± 0,87 21,566 ± 0,91 80oC giảm 10 17,741 ± 0,80 18,551 ± 0,56 19,255 ± 0,81 xuống nhiệt 20 17,914 ± 0,73 20,805 ± 0,89 20,974 ± 1,15 độ phịng 30 18,232 ± 0,41 21,087 ± 1,03 21.172 ± 0,93 40 18,579 ± 0,56 21,989 ± 0,99 21,595 ± 1,21 Nhằm tiết kiệm enzyme BacP, tiết kiệm thời gian và năng lượng xử lí sữa yến mạch, chúng tơi đã lựa chọn phương án bổ 40 IU/l BacP ngay sau khi cĩ được sữa yến mạch thơ thanh trùng để nguội tới 80 ºC và tiếp tục để nguội dần tới 30 ºC trước khi đem bảo quản sữa ở 10 ºC trong 7 ngày. 2.2.5. Khả năng giải phĩng các kim loại tự do trong sữa yến mạch được xử lí bằng enzyme phytase Phytate cĩ ái lực cao đối với sắt, kẽm, canxi, magie và nhiều cation kim loại thiết yếu khác trong các loại hạt ngũ cốc, là nguyên nhân dẫn đến hiện tượng giảm khả năng hấp thụ khống chất trong đường tiêu hĩa của người và động vật nuơi. Do vậy, việc loại bỏ phytate bằng enzyme BacP trong sữa yến mạch cĩ thể làm giải phĩng các ion kim loại thiết yếu này ra khỏi phức chất với phytate, làm tăng hàm lượng các ion này hịa tan trong dịch sữa. Song song với các thí nghiệm kiểm tra hàm lượng Pvc giải phĩng trong quá trình xử lí sữa yến mạch bằng enzyme BacP trong thời gian 7 ngày bảo quản sữa, chúng tơi bố trí kiểm chứng mối quan hệ giữa việc giải phĩng Pvc từ phytate trong sữa yến mạch (do xử lí bằng enzyme phytase BacP) đến sự giải phĩng các cation kim loại Fe2+, Zn2+, Mg2+ và Ca2+ từ dạng liên kết với phytate sang dạng cation tự do trong dung dịch (Hình 4). Kết quả cho thấy, cùng với việc giải phĩng Pvc làm giảm hàm lượng phytate trong sữa yến mạch, hàm lượng kim loại thiết yếu Fe2+, Zn2+, Mg2+ và Ca2+ trong sữa cũng tăng đáng kể. Cụ thể là: Hàm lượng Fe3+ trong dịch sữa trước khi xử lí là 2,84 mg/l, tăng lên 3,45 mg/l sau khi xử lí với enzyme và tiếp tục tăng lên 4,24 mg/l sau 7 ngày bảo quản ở 10ºC, nghĩa là tăng 49,3% so với dịch sữa trước khi xử lí với enzyme BacP (Hình 4A). Hàm lượng Zn2+ trong dịch sữa trước khi xử lí enzyme BacP là 1,88 mg/l tăng lên 2,49 mg/l và tiếp tục tăng đến 3,07 mg/l sau 7 ngày bảo quản ở 10 ºC (Hình 4B), nghĩa là tăng 63,3% so với dịch sữa trước khi xử lí với enzyme. Như vậy, sự giảm hàm lượng phytate trong dịch sữa yến mạch đã làm tăng sự giải phĩng Fe2+ và Zn2+ hịa tạn trong dịch sữa, qua đĩ tăng hàm lượng sắt và kẽm dễ tiêu. Kết quả này tương đồng với các báo cáo của Marine L và cộng sự (1996), báo cáo đã chứng minh rằng sự giảm phytate trong khẩu phần ăn cĩ chứa hạt yến mạch nảy mầm làm tăng khả năng hấp thu kẽm ở người và động vật [22]. Hàm lượng Mg2+ (Hình 4C) tăng từ 121,01 mg/l trong sữa yến mạch chưa xử lí BacP lên 187,69 mg/l sau khi xử lí bằng enzyme phytase BacP, sau đĩ, cĩ xu hướng tăng nhẹ và duy trì ổn định ở mức 236,65 mg/l sau ngày thứ 5 và 7 bảo quản ở 10ºC (tăng 95,56% so với dịch sữa 113
8. Trần Thị Thúy và Lê Thị Hồng trước khi xử lí với enzyme). Trái với các ion kim loại trên, hàm lượng Ca2+ trong sữa yến mạch tăng khơng nhiều (Hình 4D): trước khi được xử lí bằng enzyme phytase là 12,25 mg/l, sau khi xử lí sữa bằng enzyme BacP đạt 15,56 mg/l (tăng 27%) và hầu như khơng tăng trong thời gian bảo quản sữa. So sánh hàm lượng canxi trong sữa sau khi được xử lí với hàm lượng canxi thành phần dinh dưỡng của sữa yến mạch “Organic Long Life Oat Milk” đã được cơng ty Pureharvest cơng bố thì hàm lượng canxi trong sản phẩm sữa đã được xử lí với enzyme BacP của chúng tơi đạt mức cao hơn [23]. Hình 4. Hàm lượng các cation kim loại hịa tan trong sữa yến mạch trước khi xử lí, ngay sau khi xử lí với enzyme BacP và trong thời gian bảo quản sữa: (A) Hàm lượng Fe2+, (B) Hàm lượng Zn2+; (C) Hàm lượng Mg2+ và (D) Hàm lượng Ca2+ Nhìn chung, hàm lượng Fe2+, Zn2+, Mg2+ và Ca2+ hịa tan trong sữa yến mạch tăng chủ yếu trong giai đoạn xử lí sữa sau thanh trùng, đồng hành với sự giải phĩng Pvc do enzyme phytase BacP thủy phân phytate trong sữa. Trong thời gian bảo quản sữa, hàm lượng các kim loại này cũng tăng lên đáng kể (trừ trường hợp của Ca2+) nhưng thường ổn định, khơng tăng sau 3 ngày bảo quản ở 10ºC (Hình 4). Sản phẩm sữa yến mạch được xử lí bằng enzyme phytase cho hàm lượng các ion kim loại thiết yếu, đặc biệt là canxi, sắt, kẽm tự do cao sẽ là cơ sở để tăng khả năng hấp thụ khống chất của cơ thể, gĩp phần ngăn ngừa một số bệnh lí về xương, răng cho những người sử dụng các sản phẩm sữa này. 3. Kết luận Bổ sung enzyme BacP (nồng độ 40 IU/l) vào sữa yến mạch sau khi thanh trùng và để nguội sữa đến 80 ºC, rồi tiếp tục để nguội sữa đến 30 ºC trước khi bảo quản ở 10 ºC đã giúp giải 114
9. Nghiên cứu sử dụng enzyme phytase để nâng cao giá trị dinh dưỡng khống trong sữa yến mạch phĩng 20 - 30% hàm lượng phốt phát vơ cơ từ phytate trong sữa, đặc biệt làm tăng hàm lượng các khống dễ tiêu (Ca2+, Fe2+, Zn2+và Mg2+) trong sữa từ 27 đến 95,56% so với sữa khơng được xử lí enzyme. Như vậy, bên cạnh việc làm giảm hàm lượng chất kháng dinh dưỡng phytate, việc sử dụng phytase để xử lí sữa cũng gĩp phần làm tăng giá trị dinh dưỡng khống trong sữa yến mạch. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Rasane P, Jha A, Sabikhi L, Kumar A & Unnikrishnan VS, 2013. Nutritional advantages of oats and opportunities for its processing as value added foods - a review. J. Food Sci. Technol, 52(2), pp. 662-675. [2] Braaten T, Wood PJ, Scott FW, Wolynetz MS, Lowe MK, Bradley-White P, Collins MW, 1994 beta-glucan reduces blood cholesterol concentration in hypercholesterolemic subjects. Division of Endocrinology and Metabolism. Eur. J. Clin Nutr., 48(7), pp. 465-474. [3] Cheryan M, 1980. Phytic acid interactions in food systems. CRC Crit Rev Food Sci Nutr., 13, pp. 297-335. [4] Sajjadi M, Carter CG, 2004. Effect of phytic acid and phytase on feed intake, growth, digestibility and trypsin activity in Atlantic salmon. L. Aquacult Nutr., 10, pp. 135-142. [5] Davies NT, 1982. Effects of phytic acid on mineral availability, In Dietary Fiber in Health and Disease, Vahoung GV and Kritchevsky D, Eds, Plenum Press, New York. pp. 105-116. [6] Phillippy BQ, Wyatt CJ, 2001. Degradation of phytate in foods by phytases in fruits and vegetable extracts. J. Food Sci., 66, pp. 535-539. [7] Anno T, Nakanishi K, Matsuno R and Kamikubo T, 1985. Enzymatic elimination of phytate in soybean milk. J. Japan Soc. Food Sci. Technol, 32, pp. 174-180. [8] Simell M, Elovainio M, Vaara M, Vaara T, 1990. Novel method for production of phytate- free or low-phytate soy protein isolate and concentrate. Patent WO 90/08476. [9] Greiner R, Konietzny U, 2006. Phytase for food application. Food Technol Biotechnol, 44, pp. 125-140. [10] Tsumura K, Saito T, Kugimiya W, 2004. Influence of phytase treatment on the gelation property of soymilk. Food Sci Technol Res, 10 (4), pp. 442-446. [11] Bradford M, 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principal of protein dye binding. Anal. Biochem, 72, pp. 248-254. [12] Shimizu M, 1992. Purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis (natto) N-77. Biosci. Biotechnol Biochem., 56(8), pp. 1266-1269. [13] Phạm Luận, 2009. Phương pháp phân tích phổ nguyên tử, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, tr. 38-49. [14] Hídvégi M, Lásztity R, 2002. Phytic acid content of cereals and legumes interaction with proteins. Periodica Polytechnica Ser Chem Eng, 46(1-2), pp. 59-64. [15] x=25&offset=&sort=&qlookup=oat. [16] Hà Thị Anh Đào, Nguyễn Cơng Khẩn, 2007. Thành phần thực phẩm Việt Nam, NXB Đại học Y, tr. 82, 93. [17] Tran TT, Mamo G, Mattiasson B and Hatti-Kaul R, 2010. A thermostable phytase from Bacillus sp. MD2: cloning, expression and high-level production in Escherichia coli. J. Industrial Microbiol Biotechnol, 37, pp. 279-287. 115
10. Trần Thị Thúy và Lê Thị Hồng [18] Oh BC, Choi WC, Park SC and Kim YO, 2004. Biochemical properties and substrate specificities of alkaline and histidine acid phosphatase. Appl Microb Biotechnol, 63, pp. 362-372. [19] Siren M, 1995. Method of treating pain using inositol triphosphate. U.S. Patent, 5407924, pp. 23-28 pp.732-739. [20] Siren M, 1998. Use of an ester of inositol triphosphate for preparing of medicaments. US Patent 5846957. [21] Tran Thi Thuy and Dao Thi Nu, 2017. Synergic effect of different phytase preparations in feed. Journal of Science of HNUE, Chemical and Biological Sciences 9/2016, 62(10), pp.143-152. [22] Larsson M, Rossander-Hulthén L, Sandstrưm B, Sandberg AS, 1996. Improved zinc and iron absorption from breakfast meals containing malted oats with reduced phytate content. Brit. J. Nutr.,76, pp.677-688. [23] ABSTRACT Study on application of phytase enzyme to improve dissolution of minerals in pasteurized oat milk Tran Thi Thuy and Le Thi Hong Faculty of Biology, Hanoi National University of Education Oat milk is a nutritious product which has been used as a nutritional supplement by European people of all ages. However, the concentration of phytate, an anti-nutritional compound, in oat seed is quite high (about 1 - 3% of seed dry weight). Phytate forms undissolved complexes with many vital metal ions in oat milk causing a reduction in the efficacy of mineral absorption. In this study, phytase enzyme BacP was chosen at the concentration of 40 IU/l to degrade phytate in pasteurized oat milk, whereupon 20 - 30% of the inorganic phosphate was released from phytate in oat milk, along with increases in the level of dissolved mineral ions (Ca2+: 27.0%; Fe2+: 49.3%, Zn2+: 63.3% and Mg2+: 95.6%) compared to untreated milk. This study proves the role of BacP in degrading phytate and improving the nutrition of eupeptic minerals in oat milk. Keywords: mineral absorption, inorganic phosphate, oat milk, phytase, phytate. 116