Thiết lập quy trình real-time PCR phát hiện gen tropomyosin gây dị ứng có nguồn gốc hải sản

Nội dung text: Thiết lập quy trình real-time PCR phát hiện gen tropomyosin gây dị ứng có nguồn gốc hải sản

1. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số7(1), 2021 THIẾT LẬP QUY TRÌNH REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN GEN TROPOMYOSIN GÂY DỊ ỨNG CÓ NGUỒN GỐC HẢI SẢN Phan Đặng Hoàng Nam*, Nguyễn Thanh Tùng, Quang Trọng Minh, Võ Thanh Nhàn, Lê Thị Tuyết Trinh, Lao Đức Thuận Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh *Tác giả liên lạc: kingleys1459@gmail.com TÓM TẮT Hải sản là nguồn thực phẩm cung cấp protein quan trọng trong khẩu phần ăn trên thế giới. Bên cạnh nhiều lợi ích do hải sản mang lại như ngăn ngừa tim mạch, bổ sung lượng vi lượng, đa lượng cao, v.v thì chính hải sản lại là nguồn gây dị ứng ảnh hưởng đến sức khỏe, thậm chí đe dọa đến tính mạng của con người với các triệu chứng liên quan đến hệ miễn dịch: phát ban đỏ, viêm da, hen suyễn, v.v Gen Tropomyosin– mã hóa cho protein Tropomyosin, phân tử gây dị ứng chính có nguồn gốc hải sản. Do đó, nghiên cứu này hướng tới thiết lập một quy trình phát hiện, cụ thể là quy trình Real-time PCR, để phát hiện gen Tropomyosin - thành phần gây dị ứng có nguồn gốc hải sản có thể ứng dụng tại Việt Nam. Kết quả, xây dựng thành công chứng dương cho quy trình Real-time phát hiện gen Tropomyosin: vectơ tái tổ hợp pUC19-Tropo; thiết kế thành công quy trình Real-time PCR với cặp mồi TropoF và TropoR (khuếch đại gen Tropomyosin), cặp mồi N18SF và N18SR (khuếch đại gen 18S rRNA - chứng nội) ứng dụng trong khuếch đại gen Tropomyosin có nguồn gốc hải sản với các thông số: giới hạn phát hiện: 101 , %CV của nội phản ứng: 3,64%, %CV của liên phản ứng: 2,81%. Tỷ lệ mẫu thực phẩm thương mại dương tính với gen Tropomyosin là 37/56 mẫu đạt 66,1%. Việc phát hiện thành công thành phần gây dị ứng có thể hỗ trợ cho nhà sản xuất thực phẩm có thể đánh dấu trên nhãn hiệu giúp người tiêu dùng có thể lựa chọn sử dụng hay không? Từ đó, giúp giảm tỷ lệ gây dị ứng ở người sử dụng các thực phẩm chế biến sẵn. Từ khóa: Dị ứng thực phẩm, dị ứng hải sản, Tropomyosin, 18S rRNA. ESTABLISHING THE REAL-TIME PCR ASSAY TO DETECT TROPOMYOSIN GENE CAUSING ALLERGY OF SEAFOOD ORIGIN Phan Dang Hoang Nam*, Nguyen Thanh Tung, Quang Trong Minh, Vo Thanh Nhan, Le Thi Tuyet Trinh, Lao Duc Thuan Ho Chi Minh City Open University *Corresponding author: kingleys1459@gmail.com ABSTRACT Seafood is an important dietary source of protein in the world. In addition to the many benefits of seafood such as heart prevention, micronutrient supplementation, high macronutrients, etc., seafood itself is the source of allergies affecting health, even threatening to human’s life with symptoms related to the immune system: red rash, dermatitis, asthma, etc. Gen Tropomyosin - encodes for the protein Tropomyosin, the main allergenic molecule of seafood origin. Therefore, this study aims to establish a detection process, namely Real-time PCR assay, to detect the Tropomyosin gene - a seafood-derived allergen that can be applied in Vietnam. The results, successfully built a positive control for the Real-time assay of detecting the Tropomyosin gene: recombinant vector pUC19-Tropo; Successful design of Real-time PCR assay with TropoF and TropoR primers (amplification of Tropomyosin gene), N18SF and N18SR primers (amplification of 18S rRNA gene – internal control) applied in Tropomyosin gene 67
2. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số7(1), 2021 amplification of seafood origin with the following parameters: detection limit: 101,% CV of the intra assay: 3.64%,% CV of the inter assay: 2.81%. The percentage of commercial food samples positive for Tropomyosin gene was 37/56, reaching 66.11%. Can the successful detection of an allergen help food manufacturers to put a mark on the label so that consumers can choose to use it? Thereby, it helps to reduce the rate of allergies in people using processed foods. Keywords: Food Allergy, Allergic seafood, Tropomyosin, 18S rRNA. TỒNG QUAN cho việc hít thở khó khăn; huyết áp sụt Việc tiêu thụ hải sản là một nguyên nhân giảm một cách nghiêm trọng; mạch đập phổ biến dẫn đến dị ứng. Hải sản bao gồm nhanh, chóng mặt, choáng hoặc bất các sinh vật biển đa dạng và con người bị tỉnh; (Sampson và cộng sự , 2003). dị ứng với nhiều trong số chúng. Trong số Shanti và cộng sự (1993) đã xác định được tất cả các dị ứng thực phẩm, dị ứng động chất gây dị ứng ổn định nhiệt chính của vật có vỏ là một trong những loại phổ biến tôm, Tropomyosin, có khả năng gây ra nhất với tỷ lệ mắc 0,60% trong dân số thế phản ứng quá mẫn khi tiêu thụ tôm. Sau giới, và đặc biệt phổ biến ở các nước châu đó, Tropomyosin cũng được xác định là Á (Lehrer và cộng sự , 1992). Động vật có chất gây dị ứng trong động vật có vỏ, bao vỏ cũng được coi là một trong bốn loại thực gồm nhóm động vật giáp xác, bao gồm phẩm phổ biến nhất, có thể gây sốc phản cua, tôm và một nhóm động vật thân mềm, vệ. Động vật có vỏ được phân loại thành bao gồm động vật thân mềm 2 mảnh vỏ, động vật thân mềm và động vật giáp xác. động vật chân bụng và động vật chân đầu. Trên toàn cầu, các loài động vật có vỏ gây Do đó, Tropomyosin được xác định là bệnh phổ biến nhất là tôm, cua, tôm hùm, mục tiêu phân tử để xác định chất gây dị trai, sò và trai. Tỷ lệ dị ứng động vật có vỏ ứng trong tôm, thức ăn có thành phần từ được ước tính là 0,50-2,50 % dân số nói tôm và các loại thức ăn có vỏ khác. Lượng chung nhưng cao hơn ở các nước ven biển Tropomyosin gây ra phản ứng dị ứng phụ châu Á nơi động vật có vỏ chiếm tỷ lệ lớn thuộc vào độ nhạy cảm của từng cá nhân trong chế độ ăn uống. (Faber và cộng sự , và chưa có báo cáo lâm sàng. 2017). Dị ứng hải sản là một rối loạn quá Hiện tại, Việt Nam vẫn chưa có một nghiên mẫn với tỷ lệ lưu hành ngày càng gia tăng cứu nào thật sự rõ ràng về dị ứng hải sản. trên toàn thế giới. Các triệu chứng phổ biến Các nghiên cứu vẫn mang tính chất rời rạc, của dị ứng hải sản là: phát ban, ngứa hoặc chủ yếu phân tích về nguyên nhân chủ quan chàm (viêm da dị ứng); sưng môi, mặt, lưỡi đến từ cơ địa người bệnh mà chưa đi sâu về và cổ họng hoặc các bộ phận khác của cơ tính chất phân tử của các gen có trong thực thể; thở khò khè, nghẹt mũi hoặc khó thở; phẩm, điển hình là Tropomyosin. Vì vậy, đau bụng, tiêu chảy, buồn nôn hoặc nôn hướng nghiên cứu về tính chất biểu hiện, mửa; chóng mặt, choáng hoặc ngất xỉu; định lượng phân tử Tropomyosin là một ngứa ran trong miệng; Dị ứng nặng có thể hướng nghiên cứu rất tiềm năng, mở ra tầm gây ra một phản ứng nghiêm trọng có khả nhìn bao quát hơn về dị ứng hải sản, dị ứng năng đe dọa tính mạng được gọi là sốc phản tôm tại Việt Nam, phát triển phân tử vệ. Các dấu hiệu và triệu chứng củasốc Tropomyosin trở thành một dấu chứng sinh phản vệ bao gồm: cổ họng bị sưng hay học hàng đầu trong dị ứng hải sản. nghẹn trong cổ họng (co thắt phế quản) làm KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Thiết kế 2 cặp mồi: TropoF-TropoR và N18SF-N18STrình tự và các thông số vật lý của 2 cặp mồi được thể hiện trong bảng 1. Bảng 1: Trình tự và các thông số vật lý của hai cặp mồi 68
3. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số7(1), 2021 (1) (2) (3) Ký hiệu Chiều %G Tm Trình tự mồi 5’-3’ C Kcal/ Kcal/ Kcal/ mồi dài (˚C) mole mole mole TropoF TGTCTGA GGA GAA GGCCAAC 20 55 56,81 -1,56 -0,19 0,04 TropoR CAGCTCGTCGGTAATGGACT 20 55 56,72 -0,42 -0,32 N18SF CAGGTCTGTGATGCCCTTA G 20 55% 55,10 0,42 -4,67 -6,14 N18SR ACTGGGAATTCCTCGTTC 18 50% 51,70 -0,64 -3,61 Xây dựng thành công chứng dương cho vi khuẩn E. Coli TOP10 và được nuôi cấy quy trình Real-time PCR phát hiện gen chọn lọc bằng Ampicillin. Các plasmid tái Tropomyosin: vectơ tái tổ hợp pUC19- tổ hợp sẽ được thu nhận bằng bộ kit Tropo GeneEluteTM Plasmid Miniprep Kit và Trình tự gen Tropomyosin được nối vào được sử dụng như là chứng dương trong vectơ pUC19, sau đó vectơ tái tổ hợp nghiên cứu. Sơ đồ vectơ pUC19-Tropo pUC19-Tropo được biến nạp vào chủng được thể hiện ở hình 1 Hình 1: Sơ đồ vector pUC19 Tropo Giới hạn phát hiện của phản ứng Giới hạn phát hiện của phản ứng cho thấy Real-time PCR số lượng bản sao gen thấp nhất, Tropomyosin được phát hiện bởi kỹ thuật 69
4. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số7(1), 2021 Real-time PCR này. Dung dịch chứa sao/phản ứng. Kết quả phản ứng Real- vector pUC19-Tropo được tiến hành pha time PCR được thể hiện ở hình 2. loãng theo bậc 10 để đạt các nồng độ giảm từ 109 bản sao/phản ứng đến 100 bản Hình 2: Kết quả Real-time PCR ở các mẫu có nồng độ 109 đến 100 bản sao/phản ứng Phản ứng được tiến hành lặp lại 10 lần để %CV nội phản ứng là 3,61%, liên phản xác định được giới hạn phát hiện của kỹ ứng là 2,81%, với chứng dương là pUC- thuật này Dựa trên kết quả lặp lại cho Tropo, chứng nội là 18S rRNA. thấy, tỷ lệ số lần dương tính đạt 100% ở các mẫu có lượng bảnsao 102 đến 10 9. Tỷ Khảo sát chứng nội 18S rRNA lệ số lần dương tính ở các mẫu 101 và 100 Sau khi tách chiết DNA từ các mẫu thực lần lượt là 90% và 0%. Do đó, giá trị phát nghiệm, phản ứng Real-time PCR được hiện thấp nhất được xác định là 101 bản thực hiện với cặp mồi N18SF và N18SR sao/mẫu/phản ứng. khuếch đại gen18S rRNA – chứng nội cho nghiệm. Như vậy, quy trình Real-time các phản ứng khuếch đại gen mục tiêu sau PCR ứng dụng để phát hiện gen này. Kết quả Real-time PCR và kết quả Tropomyosin được xây dựng thành công của thí nghiệm khảo sát chứng nội được với độ giới hạn phát hiện là 101 bản sao, thể hiện ở hình 3 (A) (B) Hình 3: Kết quả khảo sát chứng nội. (A) Biểu đồ khuếch đại, (B) Biểu đồ phân tích đường cong nóng chảy Như vậy, kết quả thực nghiệm cho thấy phẩm tách chiết DNA được sử dụng cho phản ứng Real-time PCR khuếch đại hoàn những phản ứng khuếch đại sau này. toàn đặc hiệu với gen 18S rRNA. Hay nói Khảo sát sự hiện diện của gen cách khác, quá trình tách chiết DNAtừ Tropomyosin trên một số mẫu thực các mẫu thực nghiệm thành công và sản nghiệm 70
5. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số7(1), 2021 Tổng số mẫu thực phẩm là 54 mẫu bao khảo sát sự hiện diện của gen gồm: 44 mẫu thực phẩm có thành phần Tropomyosin trên các mẫu thực phẩm đại tôm và 10 mẫu thực phẩm không chứa diện được thể hiện ở hình 4 thành phần tôm. Kết quả Real-time PCR (A) (B) (C) Hình 4: Kết quả khảo sát sự hiện diện của gen Tropomyosin. (A) Biểu đồ khuếch đại, (B) Biểu đồ phân tích đường cong nóng chảy, (C) Kết quả điện di Phản ứng được tiến hành khảo sát trên tỷ lệ dương tính đạt 66,11%. Trong tổng một số mẫu thực phẩm đại diện và trong số các mẫu thực phẩm có chứa thành phần đó, chứng dương của phản ứng là mẫu là tôm, tỷ lệ mẫu tôm dương tính là 2/2 đạt nồng độ 101 bản sao/phản ứng. Phân tích tỷ lệ 100%, tỷ lệ số mẫu thực phẩm dương đường cong nóng chảy (hình 3B), kết quả tính là 35/44 mẫu đạt 79,50%. Và trong cho thấy, ở các mẫu dương tính đều xuất tổng số 10 mẫu đối chứng (không chứa hiện một đỉnh nóng chảy duy nhất tương thành phần tôm), không phát hiện được ứng trong khoảng nhiệt độ 85-86 oC. Điều bất kì trường hợp nào dương tính với này khẳng định sản phẩm khuếch đại là Tropomyosin. duy nhất. Kết quả điện di (hình 4C) cho Thông qua kết quả thực nghiệm, các mẫu thấy chỉ xuất hiện một băng duy nhất ở sản phẩm đóng gói dương tính với gen các mẫu dương tính với kích thước là Tropomyosin, điều này chứng tỏ rằng quy 197bp. Như vậy, kết quả thực nghiệm cho trình tách chiết DNA và quy trình Real- thấy phản ứng Real-time PCR khuếch đại time PCR của nhóm nghiên cứu rất hiệu hoàn toàn đặc hiệu và chuyên biệt với gen quả và rất nhạy vì chỉ với một lượng mẫu Tropomyosin. Kết quả dương tính được rất nhỏ nhóm nghiên cứu vẫn có thể phát ghi nhận khi 2/3 lần thí nghiệm cho kết hiện được phân tử Tropomyosin có trong quả dương tính. Tổng số mẫu dương tính thực phẩm thương mại. với gen Tropomyosin được tính là 37/56 Ngược lại với công trình nghiên cứu của mẫu (2 mẫu tôm và 54 mẫu thực phẩm), Kim và cộng sự (2019), mẫu được sử 71
6. Chuyên san Phát triển Khoa học và Công nghệ số7(1), 2021 dụng là các loài tôm như tôm hồng phát hiện gen Tropomyosin có nguồn gốc (Pandallus borealis), tôm đỏ hải sản, góp phần bổ sung vào nguồn dữ (Feneropenaeus chiensis), tôm sú Nhật liệu to lớn về dị ứng hải sản trên thế giới, Bản (Marsupenaeus jabonicus), là dựa vào nền tảng Y học thực chứng kết những loài tôm đặc trưng cho vùng biển hợp với thực nghiệm chứng minh. Đông Á. Các sản phẩm thương mại tại Việt Nam sử dụng nguồn nguyên liệu KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ chính thường là loài tôm thẻ chân trắng Bước đầu áp dụng quy trình Real-time (Penaeus vannamei), vì tôm thẻ là nguồn PCR trên 54 mẫu thực phẩm thương mại nguyên liệu giàu dinh dưỡng nhưng giá thực tế. Tỷ lệ mẫu dương tính với gen thành lại thấp và do các công ty chế biến, Tropomyosin là 37/56 mẫu đạt 66,11%. xuất khẩu thực phẩm chú trọng đến doanh Như vậy, đây là công trình nghiên cứu đầu thu, lợi nhuận của sản phẩm nên tôm thẻ được chú trọng nhiều hơn các nguồn tôm tiên ở Việt Nam xây dựng thành công quy khác. Trong nghiên cứu này, từ kết quả trình Real-time PCR phát hiện gen thu nhận được, nhóm nghiên cứu khẳng Tropomyosin – gây dị ứng hải sản. Nhóm định được kết quả này đặc hiệu với gen nghiên cứu đề nghị tiến hành kiểm tra Tropomyosin trên loài tôm thẻ- đặc trưng ngoài với quy trình Real-time PCR này để cho Việt Nam. Khẳng định rằng, đây là công trình nghiên cứu đầu tiên tại Việt hướng tới phát . Nam ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR để TÀI LIỆU THAM KHẢO FABER, M. A., PASCAL, M., EL KHARBOUCHI, O., SABATO, V., HAGENDORENS, M. M., DECUYPER, I. I., & EBO, D. G (2017). Shellfish allergens: tropomyosin and beyond. Allergy, 72(6), 842-848 KIM, M. J., KIM, H. I., KIM, J. H., SUH, S. M., & KIM, H. Y. (2019). Rapid on-site detection of shrimp allergen tropomyosin using a novel ultrafast PCR system. Food science and biotechnology, 28(2), 591-597. LEHRER, S. B., HELBLING, A., & DAUL, C. B. (1992). Seafood allergy: prevalence and treatment. Journal of food safety, 13(1), 61-76. SAMPSON, H. A. (2003). Anaphylaxis and emergency treatment. Pediatrics, 111(Supplement 3), 1601-1608. SHANTI, K. N., MARTIN, B. M., NAGPAL, S., METCALFE, D. D., & RAO, P. V. (1993). Identification of tropomyosin as the major shrimp allergen and characterization of its IgE-binding epitopes. The Journal of Immunology, 151(10), 5354-5363. 72