Antibiotics resistance in pathogenic bacteria isolated from water and sediment around the floating fish farms in the Nha Trang bay

Nội dung text: Antibiotics resistance in pathogenic bacteria isolated from water and sediment around the floating fish farms in the Nha Trang bay

1. Vietnam Journal of Marine Science and Technology; Vol. 20, No. 4A; 2020: 199–209 DOI: Antibiotics resistance in pathogenic bacteria isolated from water and sediment around the floating fish farms in the Nha Trang bay Nguyen Kim Hanh*, Nguyen Trinh Duc Hieu, Nguyen Minh Hieu, Vo Hai Thi, Pham Thi Mien, Hoang Trung Du, Phan Minh Thu, Nguyen Huu Huan Institute of Oceanography, VAST, Vietnam *E-mail: nguyenkimhanh84@gmail.com Received: 28 August 2020; Accepted: 26 October 2020 ©2020 Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) Abstract To assess the impact of antibiotic use in aquaculture in Nha Trang bay, we conducted this study with the aim of assessing antibiotic resistance of opportunistic pathogenic bacteria isolated from water and sediment around shrimp/fish cages in the Nha Trang bay. 109 strains of Vibrio, Salmonella-Shigella and Aeromonas groups were isolated in the surrounding environment of farming areas in Dam Bay and Hon Mieu. Antimicrobial resistance test of these 109 strains showed that in the water environment in Dam Bay, TET (96.6%) and NIT (92.5%) were the two antibiotics with the highest rates of resistant bacteria while no bacteria were resistant to RIF. All 5 types of antibiotics had a statistically insignificant percentage of antibiotic-resistant bacteria in water samples at Hon Mieu, ranging from 33.3% to 68.9%. Also in the water environment, the rate of antibiotic-resistant bacteria in Dam Bay was not influenced by the distance to the cages (42.5–66.6%). Meanwhile, in Hon Mieu, the highest rate of resistant bacteria was observed at the distance of 200 m (100%) away from cages and the lowest rate at the distance of 100 m (20%). In the sediment environment around the cages, both the Dam Bay and Hon Mieu farming areas showed the highest rates of antibiotic-resistant bacteria against TET, NIF and RIF had the lowest rate of resistant bacteria. Among the total of 109 strains tested for antibiotic resistance, 2 strains labeled TCBS_HM200 m and SS_HM200 m were found to be resistant to all 5 tested antibiotics. These two strains were respectively identified as Vibrio harveyi and Oceanimonas sp. Keywords: Antibiotic resistance, aquaculture, Nha Trang, pathogens, sediment, water. Citation: Nguyen Kim Hanh, Nguyen Trinh Duc Hieu, Nguyen Minh Hieu, Vo Hai Thi, Phan Thi Mien, Hoang Trung Du, Pham Minh Thu, Nguyen Huu Huan, 2020. Antibiotics resistance in pathogenic bacteria isolated from water and sediment around the floating fish farms in the Nha Trang bay. Vietnam Journal of Marine Science and Technology, 20(4A), 199–209. 199
2. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Biển, Tập 20, Số 4A; 2020: 199–209 DOI: Kháng kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh cơ hội phân lập từ môi trƣờng nƣớc và trầm tích quanh khu vực nuôi trồng thuỷ hải sản tại vịnh Nha Trang Nguyễn Kim Hạnh*, Nguyễn Trịnh Đức Hiệu, Nguyễn Minh Hiếu, Võ Hải Thi, Phạm Thị Miền, Hoàng Trung Du, Phan Minh Thụ, Nguyễn Hữu Huân Viện Hải dương học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Việt Nam *E-mail: nguyenkimhanh84@gmail.com Nhận bài: 28-8-2020; Chấp nhận đăng: 26-10-2020 Tóm tắt Để đánh giá mức độ ảnh hưởng của việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản ở vịnh Nha Trang, đề tài này được tiến hành với mục tiêu kiểm nghiệm khả năng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh cơ hội phân lập từ nước và trầm tích quanh khu vực lồng nuôi tôm/cá. Kết quả kiểm nghiệm của 109 chủng vi khuẩn phân lập được cho thấy, ở trong môi trường nước ở Đầm Bấy, kháng sinh Tetracylin (TET) (96,6%) và Nifuroxazide (NIF) (92,5%) là 2 loại kháng sinh có tỷ lệ vi khuẩn kháng lại cao nhất trong khi không có vi khuẩn nào kháng lại Rifampicine (RIF). Cả 5 loại kháng sinh này đều có tỷ lệ vi khuẩn KKS không khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê trong khảo sát ở môi trường nước Hòn Miễu. Cũng ở môi trường nước, tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh ở Đầm Bấy không bị chi phối bởi khoảng cách đối với lồng nuôi (42,5– 66,6%). Trong khi đó, ở Hòn Miễu, ở khoảng cách 200 m (100%) cách từ lồng nuôi cho kết quả tỷ lệ kháng kháng sinh cao nhất và thấp nhất ở khoảng cách 100 m (20%). Trong môi trường trầm tích quanh lồng nuôi, ở cả 2 vùng nuôi Đầm Bấy và Hòn Miễu đều cho kết quả tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh cao nhất đối với kháng sinh TET và NIT và kháng sinh RIF có tỷ lệ vi khuẩn kháng lại thấp nhất. Trong tổng 109 chủng được kiểm tra khả năng kháng kháng sinh, có 2 chủng ký hiệu TCBS_HM200 m và SS_HM200 m có khả năng kháng với cả 5 loại kháng sinh thử nghiệm. Hai chủng này được định danh lần lượt là Vibrio harveyi và Oceanimonas sp. Từ khoá: Kháng kháng sinh, lồng nuôi tôm cá, Nha Trang, nước, trầm tích, vi khuẩn. MỞ ĐẦU trường từ nhiều nguồn khác nhau, ví dụ như Hiện nay, hiện tượng kháng kháng sinh chất thải từ các khu trồng trọt, nuôi trồng thuỷ (KKS) của vi khuẩn ảnh hưởng đến khả năng hải sản hoặc từ nguồn thải bệnh viện, trung tâm điều trị các bệnh gây ra bởi vi khuẩn và đòi hỏi y tế, các cơ sở chăn nuôi gia súc, [3]. Những phải nỗ lực tìm kiếm các giải pháp chữa trị mới chất kháng sinh từ các hoạt động trên đang để ngăn chặn [1, 2]. Bên cạnh việc tìm kiếm ngày càng được sử dụng phổ biến nhưng chính các phương pháp chữa trị thay thế mới thì một sách quản lý còn chưa được hiệu quả. vấn đề khác cũng cần phải được chú trọng hơn Nuôi trồng thuỷ hải sản là một trong những là việc điều tra nguồn gốc và hạn chế việc sử hoạt động góp phần vào việc thải một lượng dụng các chất kháng sinh. Hiện nay, một lượng lớn các chất kháng sinh ra môi trường nước rất lớn các chất kháng sinh bị thải ra môi xung quanh khu vực nuôi [4]. Việt Nam với lợi 200
3. Antibiotics resistance in pathogenic bacteria isolated thế tổng diện tích mặt nước lớn lên đến 1,7 các vi khuẩn gây bệnh cơ hội phân lập từ mẫu triệu hecta và hơn 1 triệu hecta được dùng để nước và trầm tích quanh khu vực lồng nuôi nuôi trồng thuỷ sản đã đem lại giá trị kinh tế tôm/cá ở vịnh Nha Trang. lớn và sản lượng thuỷ hải sản dồi dào cho tiêu dùng và xuất khẩu [5]. Tuy nhiên, việc xuất VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN khẩu các sản phẩm thuỷ hải sản của Việt Nam CỨU đã từng bị ngưng trệ tại thị trường các nước EU Phƣơng pháp thu mẫu do việc sử dụng quá nhiều chất kháng sinh Mẫu được thu ở khu vực lồng nuôi cá tôm trong nuôi trồng và vấn nạn ô nhiễm vùng biển tại vịnh Nha Trang là Đầm Bấy (12o11,342’ Vĩ quanh khu vực lồng bè [6]. Trong một công bố độ Bắc, 109o18,933’ Kinh độ Đông) và Hòn của nhóm nghiên cứu từ Đại học Stockholm, Miễu (12o11,048 Vĩ độ Bắc, 109o13,280’ Kinh Thuỵ Điển đã có báo cáo về tình hình sử dụng độ Đông), vào tháng 4/2019 (hình 1). Tại mỗi các chất kháng sinh trong các lồng bè nuôi khu vực, mẫu nước biển được thu ở ba khoảng trồng thuỷ sản tại vịnh Nha Trang. Trong đó, khác nhau trên mặt cách ngang tính từ lồng nuôi kết quả của công bố này cho thấy một lượng cá tôm, lần lượt là 0, 100, 200 m (hình 1B). Mẫu lớn các chất kháng sinh khác nhau như: Tetracyclin (TET), Trimethoprim (TRI), trầm tích được thu theo 6 khoảng cách tính từ Rifampicine (RIF), Nifuroxazide (NIF) và lồng nuôi cá tôm, lần lượt là 0, 25, 50, 100, 150, Colistin (COL) đã được dùng trong hoạt động 200 m (hình 1B). Mẫu được thu nhờ thợ lặn có nuôi trồng thuỷ hải sản ở vùng này. Cụ thể: khí tài (SCUBA). Các mẫu nước và trầm tích trung bình khoản 555 g kháng sinh được dùng được chứa trong các ống falcon 15 ml đã khử o cho mỗi tấn cá sản xuất và 5.555 g kháng sinh trùng, giữ ở nhiệt độ lạnh 4 C và vận chuyển về cho mỗi tấn tôm hùm nuôi [7]. Một phần lớn phòng thí nghiệm tại Viện Hải dương học trong các loại kháng sinh này lại bị thải ra ngoài vùng vòng 2 tiếng kể từ thời điểm thu mẫu cho các nước xung quanh, lắng đọng ở trầm tích xunh phân tích tiếp theo. quanh lồng nuôi; và gây ảnh hưởng đến sức Phân lập vi khuẩn từ mẫu nƣớc và trầm tích khoẻ của các hệ sinh thái lân cận (ví dụ như san hô, các loài cá tự nhiên, rong, tảo, ) thông qua Vi khuẩn trong mẫu nước và trầm tích được việc thay đổi cấu trúc quần xã vi sinh vật sống tăng sinh trên môi trường marine broth (MB) với tỷ lệ 1:9. Sau 24 h chuẩn bị các ống nghiệm để cùng [7, 8]. Quan trọng hơn, sự hiện diện của -2 -4 kháng sinh có thể dẫn đến sự phát triển của pha loãng liên tiếp đến nồng độ 10 , 10 trong hiện tượng kháng kháng sinh ở vi khuẩn, đặc nước muối sinh lý. Các mẫu sau khi pha loãng biệt là vi khuẩn gây bệnh mà cuối cùng có thể được sử dụng để phân lập các nhóm vi khuẩn trực tiếp gây bệnh ở người hoặc lây lan qua các Vibrio, Salmonella - Shigella, Aeromonas bằng mầm bệnh gây bệnh ở người thông qua cơ chế các môi trường đặc hiệu tương ứng sau: chuyển gene ngang [9]. Trước những thực Thiosulfate Citrate Bile Salts (TCBS), trạng về việc sử dụng các chất kháng sinh một Salmonella-Shigella (SS) và Aeromonas [10]. cách thiếu kiểm soát và mức độ nguy hại có thể Tất cả các khuẩn lạc đều được nuôi cấy ở nhiệt có đối với sức khoẻ cộng đồng thì việc tìm hiểu độ phòng (27–28oC). Các khuẩn lạc phát triển và nghiên cứu về việc sử dụng các chất kháng trên môi trường thạch sau đó tiếp tục làm thuần sinh trong hoạt động nuôi trồng thuỷ sản và bằng phương pháp ria ba chiều. đánh giá mức độ kháng kháng sinh của một số vi khuẩn gây bệnh phân lập được từ các vùng Phƣơng pháp kiểm tra khả năng kháng nuôi là một việc làm cấp thiết. Các kết quả này kháng sinh của vi khuẩn có thể cung cấp dữ liệu khoa học cho việc tìm Các chủng vi khuẩn được kiểm tra khả kiếm giải pháp quản lý và sử dụng kháng sinh năng kháng kháng sinh bằng phương pháp thử trong nuôi trồng thuỷ sản một cách an toàn, nghiệm trên đĩa 96 giếng [11]. Trước hết, các hiệu quả và bền vững. Để trả lời cho một phần dung dịch gốc của chất kháng sinh cần kiểm những câu hỏi trên, mục tiêu của nghiên cứu tra sẽ được pha theo chỉ dẫn trên lọ kháng sinh này là đánh giá khả năng kháng kháng sinh của với dung môi thích hợp. Các chất kháng sinh 201
4. Nguyen Kim Hanh et al. được chọn kiểm tra bao gồm: TET, TRI, RIF, Microplate Reader EZ400 (Anh) và kết quả NIF và COL dựa trên nghiên cứu của Hedberg thể hiện bằng các giá trị mật độ quang (OD) ở et al., [7]. Từ dung dịch gốc, pha loãng 1/2 bước song 650 nm. Trên đĩa 96 giếng sẽ có cho đến nồng độ thấp nhất cần dùng bằng thêm các giếng đối chứng âm (chỉ chưa dung dung dịch đệm PBS. Các dung dịch kháng dịch marine broth không vi khuẩn, không sinh pha loãng sẽ được bơm lên đĩa 96 giếng. kháng sinh) và đối chứng dương (chỉ có vi Tiếp theo, 100 µl dung dịch tăng sinh vi khuẩn khuẩn trong dung dịch marine broth và không (nồng độ 106 tế bào/ml, so sánh với độ đục có kháng sinh). Nếu chủng vi khuẩn kiểm định chuẩn McFarland 0,5) sẽ được bơm vào mỗi phát triển được (có chỉ số OD tương đồng với giếng có chứa nồng độ kháng sinh khác nhau. chỉ số ở lô đối chứng dương) ở tất cả các nồng Ủ đĩa ở nhiệt độ 28–30oC trong vòng 24 h. Sự độ kháng sinh khác nhau là chủng vi khuẩn phát triển vi khuẩn sẽ được đọc bằng máy kháng kháng sinh. Hình 1. Bản đồ thu mẫu: (A) Vị trí 2 khu vực thu mẫu tại Hòn iễu và Đầm Bấy, (B) Sơ đồ thu mẫu nước và trầm tích dưới lồng nuôi tôm cá [Nguồn: Bản đồ Việt Nam ] Phƣơng pháp định danh vi khuẩn bằng ứng PCR với cặp mồi 27F và 1495R có trình tự phƣơng pháp sinh học phân tử 27F: 5’ GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG Các mẫu vi khuẩn có khả năng kháng cả 5 3’; 1495R: 5’CTA CGG CTA CCT TGT TAC loại kháng sinh được gửi tới phòng xét nghiệm GA 3’ [12]. Sản phẩm PCR được tinh chế và công ty TNHH DV và T Nam Khoa để định giải trình tự bằng phương pháp Sanger (Thực danh. Cụ thể, phương pháp giải trình tự 16S hiện bởi công ty TNHH Nam Khoa). Các trình rRNA được tiến hành để định danh các vi tự nucleotide đọc được được so sánh với các khuẩn gây bệnh có dấu hiệu kháng lại cả 5 loại trình tự của gen 16S rRNA của các chi tương kháng sinh thử nghiệm. Ban đầu, bộ gen vi ứng đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu khuẩn được tách chiết bằng bộ kit của QIAgen của NCBI bằng cách sử dụng công cụ BLAST và khuếch đại trình tự 16S rRNA bằng phản 2.8.1. 202
5. Antibiotics resistance in pathogenic bacteria isolated Phƣơng pháp xử lí số liệu Kết quả thử nghiệm độ nhạy cảm vi khuẩn Phần mềm Excel được sử dụng để tính toán phân lập từ môi trường nước xung quanh lồng các số liệu và lập bảng biểu và vẽ đồ thị. Kiểm nuôi đối với 5 loại kháng sinh thử nghiệm được định phi tham số Kruskal Wallis được sử dụng thể hiện ở bảng 1, hình 2, 3. Cụ thể, ở khu vực để so sánh sự khác biệt trong tỷ lệ vi khuẩn Đầm Bấy, kết quả cho thấy tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh giữa các kháng sinh khác kháng kháng sinh đối với các kháng sinh khác nhau cũng như các khoảng cách thu mẫu khác nhau là khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê nhau. Tiếp đến, kiểm định phi tham số (Kruskal-Wallis, P 0,05; n = 6). Trong đó, tỷ 18 chủng phân lập trên môi trường Aeromonas lệ vi khuẩn kháng kháng sinh đối với 3 loại agar. Trong tổng số 109 chủng vi khuẩn phân kháng sinh TET, COL và NIF là khá tương lập, có 53 chủng phân lập từ khu lồng nuôi ở đồng nhau, lần lượt là 63,3% ± 0,0; 62,2% ± Đầm Bấy và 56 chủng từ Hòn Miễu. 0,0; 68,9% ± 0,0. Tỷ lệ vi khuẩn kháng lại Kết quả thử nghiệm khả năng kháng kháng kháng TRI (38,8%) và RIF (33,3%) thấp hơn 3 sinh của các chủng vi khuẩn phân lập loại kháng sinh trên, tuy nhiên sự khác nhau Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh trong môi này không có ý nghĩa về mặt thống kê (bảng 1, trường nước hình 3). Bảng 1. Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh (%) trong môi trường nước ở Đầm Bấy và Hòn Miễu TET COL TRI NIT RIF Đầm Bấy 96,6 ± 0,0a 51,6 ± 0,1ab 19,4 ± 0,1b 92,5 ± 1,1a 0,0 ± 0,0c Hòn Miễu 63,3 ± 0,0 62,2 ± 0,0 38,8 ± 0,1 68,9 ± 0,0 33,3 ± 0,0 Ghi chú: Số liệu thể hiện giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 6); các chữ cái a, b, c khác nhau trong cùng 1 hàng biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%. Kết quả tương tự được báo cáo trong Oanh và nnk., [15] xác định định tính kháng nghiên cứu của Kim et al., [13] khi cho thấy thuốc kháng sinh của vi khuẩn phân lập từ các toàn bộ chủng vi khuẩn phân lập (151 chủng) hệ thống nuôi thủy sản ở đồng bằng sông Cửu được trong nghiên cứu này đều cho kết quả ong cho thấy tỷ lệ vi khuẩn kháng TET là kháng lại kháng sinh TET. Trong một nghiên 86%, của NIF là 57%. Kết quả của chúng tôi cứu khác của Matyar et al., [14] kết quả cho thu được ở đ y cũng giống với kết quả nghiên thấy tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh với NIF cứu của Ferrini et al., [16] công bố các chủng là 60%. Theo báo cáo của Đặng Thị Hoàng Vibrio phân lập từ nước biển, các loài hải sản 203
6. Nguyen Kim Hanh et al. có tỷ lệ kháng lại kháng sinh TET là cao Kết quả so sánh tỷ lệ vi khuẩn kháng (97%). kháng sinh ở các khoảng cách thu mẫu khác nhau (0, 100 và 200 m) tính từ lồng nuôi Nƣớc biển (Đầm Bấy) tôm/cá thu tại 2 điểm Đầm Bấy và Hòn Miễu cho thấy những xu hướng khác nhau ở 2 địa điểm thu mẫu này (bảng 2). Trong đó, ở Đầm Bấy, tỷ lệ vi khuẩn kháng lại các kháng sinh 0 m thử nghiệm trong nghiên cứu không khác nhau 100 m về mặt thống kê giữa các khoảng cách thu mẫu 200 m (Kruskal-Wallis, P < 0,05; n = 10). Cụ thể, tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh ở ngay lồng nuôi (0 m) (42,5% ± 0,1) tương đồng với tỷ lệ này ở khoảng cách cách đó 100 m (47,0% ± 0,4). Hình 2. Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh từ Ở khoảng cách 200 m từ trung tâm lồng nuôi, mẫu nước ở Đầm Bấy ở cá khoảng cách thu tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh (66,6% ± 0,1) mẫu khác nhau tính từ lồng nuôi tôm/cá cao hơn ở trung tâm và khoảng cách 100 m, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa Nƣớc biển (Hòn Miễu) về mặt thống kê. Ngược lại, ở môi trường nước quanh Hòn Miễu, có sự khác biệt về mặt thống kê trong tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh ở các khoảng 0 m 100 m cách thu mẫu khác nhau (Kruskal-Wallis, P < 200 m 0,05; n = 10). Trong đó, tất cả các chủng phân lập được ở ở vị trí 200 m đều có khả năng kháng ít nhất một loại kháng sinh (100,0% ± 0,0) (Wilcoxon, P < 0,05; n =10). Tỷ lệ này Hình 3. Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh từ cao gấp 2,3 và 5 lần so với số liệu thu được ở nước ở Hòn Miễu ở các khoảng cách thu mẫu trung tâm lồng nuôi (43,3% ± 0,1) và ở khoảng khác nhau tính từ lồng nuôi tôm/cá cách 100 m từ lồng nuôi (20,0% ± 0,0). Bảng 2. Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh (%) trong nước ở 3 khoảng cách khác nhau từ lồng nuôi tôm/cá (0, 100 và 200 m) ở Đầm Bấy và Hòn Miễu 0 m 100 m 200 m Đầm Bấy 42,5 ± 0,1 47,0 ± 0,4 66,6 ± 0,1 Hòn Miễu 43,3 ± 0,1a 20,0 ± 0,0 a 100,0 ± 0,0 b Ghi chú: Số liệu thể hiện giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 10); các chữ cái a, b, c khác nhau trong cùng 1 hàng biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%. Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh trong trầm NIF, với tỉ lệ lần lượt là 94,6% ± 0,1b tích (Wilcoxon, P < 0,05; n = 10) và 86,7% ± 1,1b Kết quả thử nghiệm độ nhạy cảm vi khuẩn (Wilcoxon, P < 0,05; n = 10). Tỷ lệ vi khuẩn phân lập từ trầm tích xung quanh lồng nuôi đối kháng lại kháng sinh COL (40,6% ± 0,1a) thấp với 5 loại kháng sinh thử nghiệm được thể hiện hơn khoảng 2,3 lần so với TET và NIF ở hình 4, 5 và bảng 3. Cụ thể, ở khu vực Đầm (Wilcoxon, P < 0,05; n = 10). Tiếp theo là chỉ Bấy, kết quả cho thấy tỷ lệ vi khuẩn kháng có khoảng 1/5 số vi khuẩn phân lập được tại đ y kháng sinh đối với các kháng sinh khác nhau là có khả năng kháng lại kháng sinh TRI (24,9% ± khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê (Kruskal- 0d). Không có chủng vi khuẩn nào phân lập Wallis, P < 0,05, n =10). Trong đó, kháng sinh trong mẫu trầm tích ở Đầm Bấy có khả năng có tỷ lệ vi khuẩn kháng lại cao nhất là TET và kháng lại kháng sinh RIF (hình 4, bảng 3). 204
7. Antibiotics resistance in pathogenic bacteria isolated Trầm tích (Đầm Bấy) cũng cho thấy có sự khác nhau về mặt thống kê đối với các kháng sinh khác nhau (Kruskal- Wallis, P < 0,05; n = 10). Trong đó, tỷ lệ vi 0 m khuẩn kháng kháng sinh đối với 2 loại kháng 25 m sinh TET, NIF lần lượt là 96,7% ± 0,3; 99,1% 50 m 100 m ± 0,8. Tỷ lệ vi khuẩn kháng lại kháng sinh COL 150 m thấp hơn khoảng 1,7 lần so với TET và NIF 200 m (Wilcoxon, P < 0,05; n = 10). Tỷ lệ vi khuẩn kháng lại kháng TRI (30,4% ± 0,1) và RIF (2,1% ± 0,0c) (hình 5, bảng 3). Hình 4. Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh từ Theo Matyar et al., (2008) [14] vi khuẩn mẫu trầm tích ở Đầm Bấy thu tại các khoảng phân lập từ trầm tích có tỷ lệ kháng lại kháng cách khac nhau sinh NIF là 60%, vi khuẩn phân lập từ mẫu tôm có tỷ lệ kháng lại kháng sinh NIF là 97,9%. Trầm tích (Hòn Miễu) Trong nghiên cứu của Neela et al., (2007) [17] về sự kháng thuốc của kháng sinh TET của các chủng Vibrio phân lập từ mẫu trầm tích và 0 m nước tỷ lệ vi khuẩn kháng là 64,8%. Đa số vi 25 m 50 m khuẩn nhạy cảm với kháng sinh RIF. Đã có 100 m nghiên cứu về tỷ lệ vi khuẩn nhạy cảm với RIF 150 m 200 m là 90% [18]. Với mẫu trầm tích ở Đầm Bấy, các khoảng cách 0, 25, 50, 100, 150, 200 m có tỷ lệ vi Hình 5. Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh từ khuẩn kháng kháng sinh giữa các khoảng cách mẫu trầm tích ở Hòn Miễu thu tại các khoảng tương đối là như nhau. Tương tự ở Hòn Miễu cách khac nhau tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh giữa các khoảng cách tương đối cũng gần giống nhau. Tương tự với khu vực Đầm Bấy, tỷ lệ vi Điều này chứng tỏ khoảng cách không ảnh khuẩn kháng kháng sinh phân lập được ở mẫu hưởng đến tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh trầm tích quanh khu vực lồng nuôi Hòn Miễu (bảng 4 và hình 4, 5). Bảng 3. Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh (%) trong trầm tích ở Đầm Bấy và Hòn Miễu TET COL TRI NIF RIF Đầm Bấy 94,6 ± 0,1b 40,6 ± 0,1a 24,9 ± 0d 86,7 ± 1,1b 0,0 ± 0,0c Hòn Miễu 96,7 ± 0,3b 56,5 ± 0,1a 30,4 ± 0,1d 99,1 ± 0,8b 2,1 ± 0,0c Ghi chú: Số liệu thể hiện giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 10); các chữ cái a, b, c khác nhau trong cùng 1 hàng biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%. Bảng 4. Tỷ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh (%) trong trầm tích thu ở 6 khoảng cách khác nhau từ lồng nuôi tôm/cá (0, 25, 50, 100, 150 và 200 m) ở Đầm Bấy và Hòn Miễu 0 m 25 m 50 m 100 m 150 m 200 m Đầm Bấy 58,3 ± 0,4 53,3 ± 0,1 53,3 ± 0 47,1 ± 0,1 35 ± 0 51,4 ± 0 Hòn Miễu 57,1 ± 0 51,6 ± 0,1 65,7 ± 0,4 48 ± 0,2 56,2 ± 0,4 56,2 ± 0,4 Ghi chú: Số liệu thể hiện giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (n = 10); các chữ cái a, b, c khác nhau trong cùng 1 hàng biểu thị sự khác nhau có ý nghĩa về mặt thống kê ở độ tin cậy 95%. Trong 5 loại kháng sinh thử nghiệm ở sinh có hoạt tính tốt nhất khi tỉ lệ vi khuẩn nghiên cứu này, RIF được ghi nhận là kháng kháng kháng sinh này là thấp nhất ở cả 2 địa 205
8. Nguyen Kim Hanh et al. điểm thu mẫu: Đầm Bấy (0%) và Hòn Miễu 5 loại kháng sinh sử dụng trong nghiên cứu (33,3%). Nồng độ tối thiểu của kháng RIF này. Hai chủng này đều là các chủng được phân kháng lại các vi khuẩn cao với nồng độ MIC = lập từ mẫu nước thu được ở khoảng cách 200 m 4 µg/ml. Đối với kháng sinh RIF, các vi khuẩn so với khu vực lồng nuôi ở Hòn Miễu. Trong trong nghiên cứu này hầu như không kháng lại. đó có 1 chủng được phân lập trên môi trường Khác với kết quả nghiên cứu của Đoàn Thị SS, kí hiệu là SS_HM200 m. Đặc điểm hình Minh Châu và nnk., [19] các tác giả đã công bố thái của khuẩn lạc ghi nhận sau 24 h nuôi cấy 24 chủng cho thấy các chủng Aeromonas như sau: Màu hồng nhạt, t m nhô lên, đường schubertii kháng với RIF với tỷ lệ cao (100%). kính 0,2–0,3 cm (hình 6a). Chủng còn lại được Theo một báo cáo khác về nồng độ ức chế tối phân lập trên môi trường TCBS, kí hiệu là thiểu của chủng Mycobacterium tuberculosis TCBS_HM200 m, khuẩn lạc màu vàng, có tâm, với kháng sinh RIF cho thấy nồng độ ức chế lồi, biến đổi môi trường từ xanh sang vàng, MIC = 0,2 ~ 0,5 µg/ml [20]. Với khoảng cách đường kính 0,2–0,3 cm (hình 6b). 200 m ở 2 địa điểm này đều có tỷ lệ vi khuẩn Hai chủng vi khuẩn này này sau đó được kháng kháng sinh cao (30–100%) trừ khoảng xác định hoạt tính sinh hoá bằng bộ kit API 20E và định danh dựa trên so sánh trình tự gen cách 200 m ở Đầm Bấy vì vi khuẩn ở khoảng 16S rRNA bằng chương trình Blast. cách này lại nhạy cảm với RIF. Ở địa điểm Hòn Kết quả cho thấy cả 2 chủng đều có độ Miễu, xuất hiện vi khuẩn kháng lại cả 5 loại tương đồng lần lượt là 100% và 98% về trình tự kháng sinh thử nghiệm với tỷ lệ 100%. gen 16S rRNA so với các chủng đã công bố trên Kết quả định danh vi khuẩn kháng cả 5 loại ng n hàng gen. Trong đó, chủng TCBS_HM200 kháng sinh m được xác định là chủng Vibrio harveyi và Trong 109 chủng vi khuẩn thử nghiệm, có 2 chủng SS_HM200 m là chủng Oceanmonas sp. chủng vi khuẩn được tìm thấy kháng lại với cả (bảng 5). a b Hình 6. (a) Đĩa cấy khuẩn lạc của 2 chủng TCBS_HM200 m, (b) SS_HM200 m Bảng 5. So sánh trình tự 16S rRNA của các vi khuẩn kháng 5 loại kháng sinh thử nghiệm với các trình tự tương đồng trên GenBank bằng công cụ BLAST Tổng Độ bao Mã số đăng ký trên Chủng E-value Max identities Kết luận điểm phủ GenBank TCBS_HM200 m 941 100% 0,0 100% Vibrio harveyi MF355398 SS_HM200 m 715 100% 0,0 97,83% Oceanmonas sp. NR_025027 Vibrio harveyi là vi khuẩn gram âm, hình động vật có xương sống và không xương sống que, kỵ khí tùy ý. Đ y là chủng vi khuẩn gây [21]. Trên động vật có xương như cá mập nhiều mầm bệnh nguy hiểm, gây bệnh trên cả Sandbar g y loét da [22], trên động vật không 206
9. Antibiotics resistance in pathogenic bacteria isolated xương sống như bào ngư Nhật Bản gây bệnh TÀI LIỆU THAM KHẢO đốm trắng [23]. Vibrio harveyi còn gây bệnh [1] Robinson, T. P., Bu, D. P., Carrique-Mas, viêm dạ dày [24], tổn thương mắt ở cá [25]. J., Fèvre, E. M., Gilbert, M., Grace, D., Theo nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và and Laxminarayan, R., 2016. Antibiotic nnk., (2006) [15] phân lập được chủng Vibrio resistance is the quintessential One Health harveyi chỉ kháng được hai loại kháng sinh là issue. Transactions of the Royal Society of TET và NIF với tỷ lệ 86% và 57%. Trước đó Tropical Medicine and Hygiene, 110(7), vào năm 1990, Baticados et al., [26] đã báo cáo 377–380. về tỷ lệ nhạy của Vibrio harveyi với TET là trw048. 100% và NIF là 75%. [2] WHO (World Health Organization), 2014. Oceanmonas sp. là vi khuẩn biển gram âm Antimicrobial Resistance: Global Report có khả năng sử dụng phenol làm nguồn carbon on Surveillance. Available at:. World [27]. Chủng này chưa có ghi nhận về khả năng Health Organization, Geneva gây bệnh. who.int/drugresistance/documents/surveill ancereport/en/. KẾT LUẬN [3] Gothwal, R., and Shashidhar, T., 2015. 109 chủng vi khuẩn khác nhau trong mẫu Antibiotic pollution in the environment: a trầm tích và nước biển ở khu vực nuôi trồng review. Clean–Soil, Air, Water, 43(4), thủy sản ở Đầm Bấy và Hòn Miễu đã được 479–489. phân lập và làm thuần. Trong đó, có 55 chủng 201300989. vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio, 36 chủng phân lập [4] Grenni, P., Ancona, V., and Caracciolo, Salmonella-Shigella và 18 chủng Aeromonas. A. B., 2018. Ecological effects of Ở Đầm Bấy, 53 chủng vi khuẩn phân lập được antibiotics on natural ecosystems: A và Hòn Miễu 56 chủng. review. Microchemical Journal, 136, 25– Trong môi trường nước quanh lồng nuôi ở 39. Đầm Bấy, TET và NIF là hai loại kháng sinh có 02.006. tỷ lệ vi khuẩn kháng lại cao (lần lượt là 96,6% [5] FAO, 2016. The state of world fisheries và 92,5%) và không có vi khuẩn nào kháng lại and aquaculture. kháng sinh RIF. Ở Hòn Miễu, ở khoảng cách [6] Gräslund, S., and Bengtsson, B. E., 2001. 200 m từ lồng nuôi cho tỷ lệ vi khuẩn kháng Chemicals and biological products used in kháng sinh cao nhất và thấp nhất ở khoảng cách south-east Asian shrimp farming, and their 100 m từ lồng nuôi. potential impact on the environment—a Trong môi trường trầm tích dưới lồng nuôi review. Science of the Total Environment, ở cả Đầm Bấy và Hòn Miễu, TET và NIF đều 280(1–3), 93–131. là 2 loại kháng sinh có tỷ lệ vi khuẩn kháng lại S0048-9697(01)00818-X. cao nhất và RIF có tỷ lệ vi khuẩn kháng lại [7] Hedberg, N., Stenson, I., Pettersson, M. N., thấp nhất. Warshan, D., Nguyen-Kim, H., Tedengren, Tổng 109 chủng được kiểm tra khả năng M., and Kautsky, N., 2018. Antibiotic use kháng kháng sinh, có 2 chủng ký hiệu in Vietnamese fish and lobster sea cage TCBS_HM200 m và SS_HM200 m có khả farms; implications for coral reefs and năng kháng với cả 5 loại kháng sinh thử human health. Aquaculture, 495, 366–375. nghiệm. Hai chủng này được định danh lần lượt là Vibrio harveyi và Oceanimonas sp. 06.005. [8] Lalumera, G. M., Calamari, D., Galli, P., Lời cảm ơn: Bài báo này là kết quả nghiên cứu Castiglioni, S., Crosa, G., and Fanelli, R., của đề tài cơ sở 2019 (Viện Hàn Lâm Khoa học 2004. Preliminary investigation on the Và Công nghệ Việt Nam) của Phòng Sinh thái environmental occurrence and effects of biển, Viện Hải dương học. Nhóm tác giả xin antibiotics used in aquaculture in Italy. gửi lời cảm ơn ch n thành đến đoàn nghiên cứu Chemosphere, 54(5), 661–668. thuộc đại học Stockholm, Thuỵ Điển đã hỗ trợ chúng tôi trong quá trình thu mẫu. 3.08.001. 207
10. Nguyen Kim Hanh et al. [9] Rico, A., Jacobs, R., Van den Brink, P. J., [16] Ferrini, A. M., Mannoni, V., Suffredini, and Tello, A., 2017. A probabilistic E., Cozzi, L., and Croci, L., 2008. approach to assess antibiotic resistance Evaluation of antibacterial resistance in development risks in environmental Vibrio strains isolated from imported compartments and its application to an seafood and Italian aquaculture settings. intensive aquaculture production scenario. Food Analytical Methods, 1(3), 164–170. Environmental Pollution, 231, 918–928. Doi: 10.1007/s12161-007-9011-2. [17] Neela, F. A., Nonaka, L., and Suzuki, S., 79. 2007. The diversity of multi-drug [10] Pfeffer, C. S., Hite, M. F., and Oliver, J. resistance profiles in tetracycline-resistant D., 2003. Ecology of Vibrio vulnificus in Vibrio species isolated from coastal estuarine waters of eastern North sediments and seawater. The Journal of Carolina. Applied and Environmental Microbiology, 45(1), 64–68. Microbiology, 69(6), 3526–3531. Doi: [18] Nguyen Bao Trung and Tu Thanh Dung, 10.1128/AEM.69.6.3526-3531.2003. 2018. Research of bacterial diseases on [11] Balouiri, M., Sadiki, M., and Ibnsouda, S. catfish (Rachicentron canadum) in fish K., 2016. Methods for in vitro evaluating cages in Kien Giang province, Vietnam. antimicrobial activity: A review. Journal Can Tho University Journal of Science, of Pharmaceutical Analysis, 6(2), 71–79. 54(2), 64–67. (in Vietnamese). [19] Doan Thi Minh Chau, Luu Hong Mai and [12] Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, Tu Thanh Dung, 2018. Antimicrobial D. A., and Lane, D. J., 1991. 16S susceptibility of bacterial pathogen ribosomal DNA amplification for causing internal white spot disease in phylogenetic study. Journal of snakehead fish (Channa striata) in Tra bacteriology, 173(2), 697–703. Doi: Vinh province. Can Tho University 10.1128/jb.173.2.697-703.1991. Journal of Science, 54(2), 108–115. [13] Kim, S. R., Nonaka, L., and Suzuki, S., [20] Van Ingen, J., Aarnoutse, R., De Vries, 2004. Occurrence of tetracycline G., Boeree, M. J., and Van Soolingen, D., resistance genes tet(M) and tet(S) in 2011. Low-level rifampicin-resistant bacteria from marine aquaculture sites. Mycobacterium tuberculosis strains raise a FEMS Microbiology Letters, 237(1), 147– new therapeutic challenge. The 156. 6968.2004.tb09690.x. International Journal of Tuberculosis and [14] Matyar, F., Kaya, A., and Dinçer, S., Lung Disease, 15(7), 990–992. 2008. Antibacterial agents and heavy metal resistance in Gram-negative bacteria [21] Austin, B., and Zhang, X. H., 2006. Vibrio isolated from seawater, shrimp and harveyi: a significant pathogen of marine sediment in Iskenderun bay, Turkey. vertebrates and invertebrates. Letters in Science of the Total Environment, 407(1), Applied Microbiology, 43(2), 119–124. 279–285. j.scitotenv.2008.08.014. 01989.x. [15] Dang Thi Hoang Oanh, Nguyen Thanh [22] Bertone, S., Gili, C., Moizo, A., and Phuong, Temdoung Somsiri, Supranee Calegari, L., 1996. Vibrio carchariae Chinabut, Fatimah Yussoff, Mohamed associated with a chronic skin ulcer on a Shariff, Kerry Bartie, Geert Huys, Mauro shark, Carcharhinus plumbeus (Nardo). Giacomini, Stefania Berton, Jean Swings Journal of Fish Diseases, 19(6), 429–434. and Alan Teale, 2005. Determination of antibiotic resistance of bacteria isolated d01-94.x. from aquaculture systems in the Mekong [23] Nishimori, E., Hasegawa, O., Numata, T., Delta, Vietnam. Journal of Sceince, (1), and Wakabayashi, H., 1998. Vibrio 136–144. (in Vietnamese). carchariae causes mass mortalities in 208
11. Antibiotics resistance in pathogenic bacteria isolated Japanese abalone, Sulculus diversicolor [26] Baticados, M. C. L., Lavilla-Pitogo, C. R., supratexta. Fish Pathology, 33(5), 495– Cruz-Lacierda, E. R., De La Pena, L. D., 502. and Sunaz, N. A., 1990. Studies on the [24] Lee, K. K., Liu, P. C., and Chuang, W. H., chemical control of luminous bacteria 2002. Pathogenesis of gastroenteritis Vibrio harveyi and V. splendidus isolated caused by Vibrio carchariae in cultured from diseased Penaeus monodon larvae marine fish. Marine Biotechnology, 4(3), and rearing water. Dis. Aquat. Org, 9(2), 267–277. 133–139. [27] Brown, G. R., Sutcliffe, I. C., and 002-0018-9. Cummings, S. P., 2003. Combined solvent [25] Ishimaru, K., and Muroga, K., 1997. and water activity stresses on turgor Taxonomical re-examination of two regulation and membrane adaptation in pathogenic Vibrio species isolated from Oceanimonas baumannii ATCC 700832. milkfish and swimming crab. Fish Antonie van Leeuwenhoek, 83(3), 275– Pathology, 32(1), 59–64. 283. 10.3147/jsfp.32.59. 8376. 209