Bài giảng Các phương pháp cơ bản trong chuẩn đoán vi khuẩn - Chương 4: Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật - Bùi Hồng Quân

Nội dung text: Bài giảng Các phương pháp cơ bản trong chuẩn đoán vi khuẩn - Chương 4: Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật - Bùi Hồng Quân

1. K THU T C NH T BÀO VI SINH V T Ths. B ùi H ng Quân 09.09.25.24.19/09.17.27.26.25 Email: buihongquan@hui.edu.vn Website: www.buihongquan.tk GBD gi gì n m àu xanh cho quê h ươ ng, xây d ng t ươ ng lai t ch t l ư ng cu c s ng
2. NH NG HĨ A •S cnh t bào vi sinh v t là quá trình g n t bào vi sinh v t vào phase riêng bi t tách kh i phase t do ca dung d ch, nhưng v n có kh năngtraoi ch t vi các phân t cơcht có mt trong phase t do nói trên •Cnh vi sinh v t là vi c g n t bào vi sinh v t vào ch t mang không hòa tan trong n ưc. T bào sau khi cnh có th s dng nhi u l n, không l n vào s n ph m và có th ch ng ng ng ph n ng mong mu n
3. PHÂN LO I CÁC PH ƯƠ NG PHÁP • Trên b mt ch t mang • Trong lòng ch t mang • Không mang ch t mang •Mt s phương ph áp khác: gel l nh sâu, c nh liên h p, nh photopolymer
4. CH T MANG C NH T BÀO • Vai trò: – óng vai trò quy t nh l a ch n ph ươ ng pháp – Quy t nh tính hi u qu ca quá trình c nh
5. YÊU C U • im quan tâm u tiên khi l a ch n ch t mang là ph i r ti n. iu này liên quan n hi u qu kinh t ca quy trình công ngh , c bi t là khi quy trình ó ng d ng vào quy mô công nghi p • Ch t mang ph i có tính ch t c ơ lý b n v ng, n nh. Nh ó mà ch t mang m i ch u ưc các iu ki n môi tr ưng nh ư khu y tr n, áp l c trong quy trình s n xu t •V mt hóa h c ch t mang ph i b n v ng, không tan trong môi tr ưng ph n ng • Ch t mang không ưc làm m t hay c ch ho t tính enzyme c a vi sinh v t
6. YÊU C U • Ch t mang ph i có tính kháng khu n cao, b n v ng v i s tn công c a vi sinh v t • Phù hp hình d ng thi t b ph n ng sinh h c • Ch t mang ph i ưc ch n l c sao cho c nh vi sinh vt d dàng • Ch t mang có th s dng nhi u l n • Ch t mang p h i an toàn cho môi tr ưng s ng • Ch t ang ph i cótrươngtt, có di n tích b mt ti p xúc l n. Tính ch t này c a ch t mang v a t ăng kh năng c nh vi sinh v t v a t ăng kh năngtip xúc c a cơ ch t v i enzyme, nh ó làm t ăng ho t tính enzyme và s ln tái s dng • Ch t mang có th có cu trúc siêu l , l xp, d ng h t, dng màng, d ng phim m ng
7. PHÂN LO I • Polysaccharide: cellulose, alginate, carrageenan • Protein: collagen, keratin •Hu c ơ t ng h p: polysaccharide, polyvinylacetate • Vô c ơ t nhiên: than ho t tính, zeolit, silicate • Vô c ơ t nh h p: silicagel, Al 2O3
8. ƯU IM C A T BÀO C NH •Mt t bào cao •Sn ph m s ch • Cóth tái s dng nhi u l n • Ch u ưc s tác ng bên ngoài • iu ch nh ưc kích th ưc kh i vi sinh v t c nh phù hp vi môi tr ưng ph n ng, reactor • Enzyme c a t bào v n xúc tác ph n ng hóa sinh, khôngtan trong n ưc • Kích th ưc thi t b nh , g n • Quá trình s n xu t liên t c, t bào vi sinh v t không b ra trôi •S dng ưc nhi u lo i c ơ ch t, quy trình thi t k ơngin hơn • Ch t l ưng s n ph m ng u •T bào c nh ưc b o v ít b c ch bi c ơ ch t và sn ph m cu i
9. NH ƯC IM C A T BÀO C NH • Ho t l c th p h ơn t bào t do • Trong môi tr ưng ph n ng s dng t bào c nh, không th không tránh kh i hi n t ưng r a trôi t bào ra kh i ch t mang. Các t bào này s ln vào s n ph m, d n n khó khăn trong vic chi t tách, tinh sch s n ph m, gây t n kém chi phí • pH ho t ng t i ưu b chuy n d ch sang ki m hay acid so v i t bào bình th ưng •T bào c nh c ũng òi h i v dinhdưng y có th ho t ng bình th ưng, th c hi n trao i ch t. •Cơ ch t mu n vào trong t bào th c hi n trao i ch t t o ra s n ph m ph i qua ch t mang, thành t bào, màng t bào Các ch t này nh h ưng n s th m th u vào và ra c a c ơ ch t và sn ph m
10. CÁC Y U T NH H ƯNG N T BÀO C NH •Bn thân ch t mang polymer ng ăn c n s khu ch tán t do c a các phân t theo hưng t i enzyme c ũng nh ư i kh i enzyme t ó nh h ưng t i hi u qu xúc tác c a enzyme •Nu c nh trên ch t mang có phân t lưng cao: gi m áng k ho t tính c a chúng trên b mt so v i các ch t mang có phân t lưng th p • Các tính ch t lý hoc c a ch t mang: tính k nưc, háo nưc, hòa tan, b n c ơ h c u nh h ưng nh t nh n kh năngcnh •Bn ch t hóa h c c a ch t mang c ũng nh h ưng áng k ti kh nănghp ph lêncơcht
11. nh h ưng c a s khu ch tán c ơ ch t, s n ph m và các phân t khác •Tc khu ch tán c ơ ch t, s n ph m và các ch t khác ph thu c vào các y u t : – Kích th ưc l gel c a ch t mang polymer – Tr ng l ưng phân t ca c ơ ch t –S chênh l ch n ng gi a vùng môi tr ưng vi mô xung quanh vi sinh v t và dung d ch t do – Nh ng gi i h n khu ch tán có th ưc th hi n 2 d ng hàng rào khu ch tán bên ngoài và bên trong
12. nh h ưng c a s khu ch tán c ơ ch t, s n ph m và các phân t khác • Rào khu ch tán bên ngoài xu t hi n là do có s tn ti c a l p m ng dung môi bao xung quanh h t polymer • Các ch t khu ch tán vào l p này nh s kt h p c a khu ch tán phân t th ng và si l ưu • dày c a l p ph thu c vào t c khu y tr n dung dch xung quanh các h t ch a t bào c nh • Vi c gia t ăng t c pha tr n s làm gi m rào khu ch tán bên ngoài • Trong b t k ỳ quy trình công ngh nào, t c khu y o óng vai trò h t s c quan tr ng
13. nh h ưng c a vi sinh v t • Thành ph n hóa h c, c u t o màng bào, kích th ưc, hình d ng ca nh ng loài vi sinh v t khác nhau s nh h ưng khác nhau n vi c l a ch n k thu t c nh t bào ó vào ch t mang •Bn ch t hay hình d ng loài vi sinh v t s quy t nh ki u liên k t và bn ki u liên k t hình thành gi a t bào vi sinh v t và ch t mang • Tr ng thái sinh lý c ũng nh ư ho t tính c a loài vi sinh vt nh h ưng n liên k t và bn c a nh ng liên kt ó.
14. CÁC PH ƯƠ NG PHÁP C NH T BÀO VI SINH V T • Yêu c u chung c a các ph ươ ng pháp c nh t bào vi sinh v t: – ơ n gi n – lp l i l n – Không gây bi n tính – Cho phép d dàng ki m soát ưc s lưng t bào cnh – Các t bào không b ra trôi kh i ch t mang trong quá trình s dng ho c b o qu n
15. PH ƯƠ NG PHÁP C NH T BÀO VI SINH V T TRÊN B MT CH T MANG • PH ƯƠ NG PHÁP LIÊN K T C NG HÓA TR • PH ƯƠ NG PHÁP H P PH
16. PH ƯƠ NG PHÁP LIÊN K T C NG HÓA TR • nh ngh ĩa: b n ch t liên k t c ng hóa tr là ni t bào v i ch t mang thông qua “cu n i”. C u n i này ph i có kích th ưc không l n l m và cóhai u, m t u n i polymer, u kia n i t bào • Ch t mang: cellulose, d n xu t c a cellulose, agarose, silicagel, bentonit • Cách ti n hành: – Theo m t giai on: ch t mang có kh năng liên k t tr c ti p t bào. Vi c g n s hi u qu hơn n u di n tích c a t bào và ch t mang có du ng ưc nhau – Theo hai giai on: ho t hóa ch t mang. Th ưng ưc ng d ng cnh enzyme
17. PH ƯƠ NG PHÁP H P PH • nh ngh ĩa: ???. Trong quá trình c nh vi sinh v t b ng cách h p ph có các liên k t sau ưc hình thành: – Liên k t t ĩnh in Van der walls: gi a t bào và b mt ch t mang t o nên m t s chênh l ch in th gi a b mt ch t mang và b mt t bào giúp t bào và ch t mang g n li n nhau. – Liên k t mao qu n: ch t mang có các mao qu n, khi ưc ngâm trong các huy n phù vi sinh v t s hình thành các l c mao qu n kéo huy n phù vi sinh v t vào trong long ch t mang – Liên k t ion: b mt ch t mang và vi sinh v t có mang các ion trái d u, nh vy t bào vi sinh v t liên k t ch t mang
18. PH ƯƠ NG PHÁP H P PH • Ch t mang: – Ch t mang không có cu trúc x p: th y tinh – Ch t mang không có cu trúc l xp: than ho t tính – Ch t mang cóin tích: nh a trao i ion • Cách ti n hành: – Ph ươ ng pháp c in – Ph ươ ng pháp c in có ci ti n – Ph ươ ng pháp b ơm canh tr ưng vi sinh v t qua c t ch a ch t mang
19. PH ƯƠ NG PHÁP C NH T BÀO VI SINH V T TRONG C U TRÚC GEL • nh ngh ĩa: – Polymer t o màng l ưi bao xung quanh t bào –Mng l ưi này có l nh ti m c không cho t bào chui ra kh i m ng, nhưng ng th i ln cho c ơ ch t và sn ph m t o ra có th ra vào d dàng • Các ph ươ ng pháp: – Ph ươ ng pháp c nh t bào vi sinh v t trong ion gel – Ph ươ ng pháp c nh t bào vi sinh v t trong covalent gel – Ph ươ ng pháp c nh t bào vi sinh v t trong cryogel – Ph ươ ng pháp c nh t bào vi sinh v t trong non- covalent gel
20. CNH T BÀO KHÔNG CH T MANG •C nh t bào vi sinh v t b ng liên k t chéo gi a các t bào vi sinh v t • Cách ti n hành: – Các t bào liên k t v i nhau t o thành kh i t bào – Tác nhân liên k t: glutaraldehyde, toluene, diisocyanate, hexamethylene • Vai trò c a các tác nhân: – Tính th m th u nhanh vào t bào vi sinh v t – Ph n ng ưc v i thành t bào vi sinh v t
21. CNH T BÀO KHÔNG CH T MANG • Ph ươ ng pháp c nh t bào vi sinh v t b ng màng ch n membrane: • Ví d t bào vi khu n A.xylinum trong m ng lưi cellulose, t bào n m men c nh trong mng l ưi cellulose
22. CNH T BÀO TRÊN CH T MANG ALGINATE • Tính ch t t o gel c a dung d ch alginate: –Mt trong nh ng tính ch t quan tr ng c a alginate là kh năng to gel nh ng iu ki n nh t nh – Khi cho k t h p cation hóa tr II và III , th ưng dung nh t là Ca 2+ s xu t hi n vùng ni gi a các m ch phân t alginate và to gel theo mô hình “hp tr ng”
23. CNH T BÀO TRÊN CH T MANG ALGINATE • Ph ươ ng pháp c nh s dng ch t mang alginate: – Alginate ưc ng d ng làm ch t c nh t bào do có nh ng c im: alginic acid là polyanion nên d dàn khâu m ch t o gel trong dung d ch CaCl2 và KCl, alginic acid có kh năngbaoxungquanht bào – Ph ươ ng pháp c nh t bào dung ch t mang alginate ph bi n làphươngph áp b y t bào trong lòng ch t mang –Hn h p huy n phù ca t bào vi sinh v t và ch t mang alginate ưc nh vào dung d ch a di n th c hi n ph n ng t o m ng l ưi gel – Qua ó, t bào vi sinh v t s ưc c nh trong h th ng m ng l ưi v a ưc hình thành
24. CNH T BÀO TRÊN CH T MANG CARRAGEENAN • Ch t mang carageenan: – Carrageenan là nh ng phân t polymer mch th ng, g m ~ 25000 d n xu t galactose ưc s p x p m t cách cân i – Tính ch t t o gel c a carrageenan: –Mt trong nh ng tính ch t quan tr ng nh t là kh năngto gel – Carrageenan hình thành gel trong iu ki n làm l nh dung d ch nóng ch a m t s lo i cation, c bi t là K+ và Ca 2+
25. CNH T BÀO TRÊN CH T MANG CARRAGEENAN • ưc th c hi n theo ph ươ ng pháp nh t trong long ch t mang – Làm l nh ông huy n phù t bào và carrageenan xu ng nhi t th p h ơn nhi t nóng ch y –Hn h p huy n phù ca t bào vi sinh v t và ch t mang carrageenan ư c nh vào dung d ch a di n th c hi n ph n ng t o m ng l ưi gel •T bào vi sinh v t s ưc c nh trong h th ng m ng l ưi v a ơc hình thành