Bài giảng Hoá sinh - Chương 3: Enzyme

Nội dung text: Bài giảng Hoá sinh - Chương 3: Enzyme

1. 31/07/2015 Chương 3: Enzyme I. BẢN CHẤT VÀ CẤU TẠO CỦA ENZYME I. BẢN CHẤT VÀ CẤU TẠO CỦA ENZYME II. CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA ENZYME III. TIỀN ENZYME (ZYMOGEN, PROENZYME) VÀ SỰ HOẠT HĨA Enzyme = chất xúc tác sinh học cĩ bản IV. TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYME chất protein, cĩ khả năng xúc tác đặc hiệu V. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN VẬN TỐC cho các phản ứng hĩa học nhất định PHẢN ỨNG ENZYME VI. CÁCH GỌI TÊN VÀ PHÂN LOẠI ENZYME VII.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ENZYME VIII.ỨNG DỤNG VÀ NGUỒN THU NHẬN ENZYME HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 1 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 2 Bản chất protein của enzyme Cường lực xúc tác  M = 20000 – 1000000 khơng đi qua các  Enzyme cĩ cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều so với màng bán thấm xúc tác thơng thường:  Hịa tan trong nước, dd muối lỗng, dd hữu cơ – Trong 1 phút: 3+ -6 cĩ cực, khơng hịa tan trong các dung mơi • 1mol Fe xúc tác phân ly 10 mol H2O2 khơng phân cực • 1 phân tử catalase cĩ 1 nguyên tử Fe xúc tác phân -6  Enzyme bị biến tính và mất khả năng xúc tác do ly 5.10 mol H2O2 t0 cao, acid / kiềm mạnh, muối kim loại nặng – 1g pepsine trong 2 giờ thủy phân 5kg Protein trứng luộc ở nhiệt độ bình thường  Điện ly lưỡng cực phân tách bằng pp điện di – 1 phân tử  - amilase sau 1 giây cĩ thể phân giải Bản chất hĩa học của enzyme là protein. 4000 liên kết glucoside trong phân tử tinh bột HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 3 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 4 Cấu tạo hĩa học của enzyme  Enzyme được chia thành 2 loại: – Enzyme 1 cấu tử: protein đơn giản. – Enzyme 2 cấu tử: • Phần protein (feron,apoenzyme): qđ tính đặc hiệu và  hoạt tính xúc tác của enzyme • Phần phi protein (nhĩm ngoại agon, 3+ 1 giây CatalaseFe ≈ 554 GIỜ prostetic): qđ kiểu phản ứng enzyme xúc 5 5 4 tác Khi nhĩm ngoại tồn tại và xúc tác độc 10 H2O2 10 H2O + 5.10 O2 lập gọi là coenzyme HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 5 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 6 1
2. 31/07/2015 Một số enzyme cĩ chứa hoặc cần các Cofactor nguyên tố vơ cơ để làm cofactor Cofactor Enzyme Cofactor: cĩ thể là một hoặc một số ion kim loại Fe2+, Fe3+ Cytochrome Oxydase Catalase, Peroxydase như Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ hoặc một phân tử hữu Cu2+ Cytochrome Oxydase cơ hay phức hữu cơ chứa kim loại phức tạp (gọi là Zn2+ Carbonic Anhydrase, Alcohol Dehydrogenase Mg2+ Hexokinase, Glucoso-6-phosphatase, Pyruvate kinase coenzyme) Mn2+ Arginase, Ribonucleotide reductase Một enzyme cĩ thể cần coenzyme và thêm một K+ Pyruvate kinase vài kim loại Ni2+ Urease Mo Dinitrogenase Se Glutathion eperoxidase HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 7 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 8 Một số coenzyme làm vật trung chuyển các nguyên tử hoặc các nhóm nguyên tử đặc hiệu II. Cơ chế tác dụng của enzyme Nhóm được Chất tiền thân trong thức COENZYME vận chuyển ăn của động vật có vú 1. Trung tâm hoạt động Thiamine pyrophosphate Aldehyde Thiamine (Vit B1) 2. Trung tâm điều hồ dị lập thể (Allosteric) Flavine adenine Điện tử Riboflavine (Vitamine B2) dinucleotide 3. Hệ thống đa enzyme và sự điều hịa hoạt Nicotinamide dinuclotide Điện tử Nicotinic acid (Niacin) động xúc tác của enzyme Coenzyme A Nhóm acyl Acid pantothenic 4. Các loại liên kết trong ES khi E tác dụng lên S Pyridoxal phosphate Nhóm amine Pyridoxine (Vit B6) 5. Cơ chế tác dụng của enzyme HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 9 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 10 1. Trung tâm hoạt động của enzyme 2. Trung tâm điều hồ dị lập thể Trung tâm hoạt động của enzyme = phần (Allosteric) phân tử trong cấu trúc của enzyme mà tại  Trong cấu trúc của các enzyme dị thể, enzyme điều hịa đĩ enzyme + cơ chất sản phẩm – enzyme allosteric, ngồi trung tâm hoạt động cịn cĩ – Ở enzyme 1 cấu tử: trung tâm hoạt một số vị trí khác cũng cĩ thể tương tác với các cơ chất động = các nhĩm định chức của khác gọi là “trung tâm allosteric” – trung tâm dị thể, trung acidamin (SH của Cys, OH của Ser, tâm điều hịa Tyr, nhĩm -NH2 của Lys, COOH  Các chất kết hợp với các trung tâm này được gọi là các của Glu, Asp, vịng imidazol của chất “điều hịa allosteric” – chất điều hịa dị lập thể His, indol của Trp)  Các chất này khi kết hợp với enzyme sẽ làm thay đổi – Ở enzyme 2 cấu tử, trung tâm hoạt cấu trúc khơng gian của enzyme và của trung tâm hoạt động = nhĩm ngoại (vitamin, ion kim động. Do đĩ enzyme sẽ thay đổi hoạt độ xúc tác loại) + các nhĩm định chức trong apoenzyme HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 11 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 12 2
3. 31/07/2015 2. Trung tâm điều hồ dị lập thể 2. Trung tâm điều hồ dị lập thể (Allostetic) (Allostetic)  Hầu hết các enzyme dị thể cĩ cầu trúc bậc 4, trong phân  Trong quá trình kết hợp với enzyme chất điều hịa tử cĩ hai hay cĩ một số trung tâm hoạt động cĩ khả allosteric sẽ khơng bị chuyển hĩa dưới tác động năng kết hợp với một số cơ chất của enzyme  Trong trường hợp cơ chất cĩ khả năng thực hiện chức  Các chất điều hịa allosteric cĩ khả năng làm tăng năng của chất điều hịa thì ta cĩ điều hồ đồng hướng – homotropic hoạt độ của enzyme được gọi là chất điều hịa dương, cịn các chất làm giảm hoạt độ của enzyme  Trong trường hợp chất điều hịa cĩ cấu trúc khác với cơ chất thì ta cĩ điều hịa dị hướng – heterotripic được gọi là chất điều hịa âm  Thơng thường các enzyme allosteric được điều hịa theo kiểu hỗn hợp bao gồm cả homotropic và heterotropic HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 13 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 14 3. Hệ thống đa enzyme và sự điều 4. Các loại liên kết trong ES khi E hịa hoạt động xúc tác của enzyme tác dụng lên S  Cĩ trọng lượng phân tử lớn  Khi cơ chất liên kết với enzyme tại vị trí trung  Thường chứa từ ba enzyme khác nhau trở lên tâm hoạt động sẽ hình thành phức hợp trung kết hợp chặt chẽ bằng cách tương tác khơng gian enzyme – cơ chất ES đồng hĩa trị  Liên kết chủ yếu trong phức ES:  Mỗi enzyme xúc tác một phản ứng riêng biệt – Tương tác tĩnh điện nhưng cùng với các enzyme khác xúc tác một – Liên kết hydro phản ứng tổng thể duy nhất – Tương tác Van der Waals  Ví dụ: Pyruvat dehydrogenase hay Synthetase acid béo HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 15 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 16 5. Cơ chế tác dụng của enzyme Biến thiên năng lượng tự do trong các 1 2 3 E + S ES EP E + P phản ứng hĩa học (E: enzyme, S: cơ chất, P: sản phẩm, ES: phức hợp trung gian enzyme-cơ chất)  3 giai đoạn: – Gđ 1: E +S bằng lk yếu phức enzyme- cơ chất (ES) khơng bền (xảy ra rất nhanh, NL hoạt hĩa thấp) – Gđ 2: biến đổi S sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hĩa trị tham gia phản ứng – Gđ 3: tạo thành P và E được giải phĩng ra dưới dạng tự do. HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 17 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 18 3
4. 31/07/2015 Mơ hình “Chìa và khĩa” của Fisher Mơ hình “Khớp cảm ứng” của về sự ăn khớp của enzyme và cơ Koshland về sự ăn khớp của chất (Năm 1894) Enzyme và cơ chất (Năm 1958) Cơ chất Cơ chất Cơ chất Cơ chất TT TT hoạt hoạt động động Enzy Enzym Enzy Enzyme me e me HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 19 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 20 III. Tiền enzyme (zymogen, IV. Tính đặc hiệu của enzyme proenzyme) và sự hoạt hĩa  Zymogen hay proenzyme là trạng thái chưa hoạt  Tính đặc hiệu cao của enzyme = khả năng hĩa của enzyme, cần phải cĩ một sự biến đổi xúc tác cho sự chuyển hĩa một hay một số sinh hĩa (phản ứng thủy phân chẳng hạn) để trở chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất thành enzyme hoạt động định tác dụng cĩ tính chọn lựa cao  Thơng thường 1 phần proenzyme (1 đoạn  Bao gồm: peptide) được cắt ra để hình thành trung tâm – Đặc hiệu kiểu phản ứng hoạt động của enzyme – Đặc hiệu cơ chất  Sau khi hoạt hĩa, khả năng xúc tác của enzyme bị giới hạn (tăng tính đặc hiệu), nhưng lại tăng độ bền vững và hoạt tính xúc tác lên nhiều lần HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 21 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 22 Đặc hiệu kiểu phản ứng Đặc hiệu cơ chất  Đặc hiệu kiểu phản ứng thể hiện ở chỗ mỗi  Cơ chất là chất cĩ khả năng kết hợp vào trung enzyme chỉ cĩ thể xúc tác cho một kiểu phản tâm hoạt động của enzyme và bị chuyển hĩa ứng chuyển hĩa một số chất nhất định: dưới tác dụng của enzyme – Oxy hố nhờ oxydase:  Mức độ đặc hiệu của các enzyme khơng giống nhau, người ta thường phân biệt thành các mức RCHCOOH + ½ O2 RCOCOOH + NH3 sau: NH2 – Khử cacboxyl nhờ decarboxylase: – Đặc hiệu tuyệt đối: RCHCOOH RCH2NH2 + CO2 – Đặc hiệu tương đối: NH2 – Đặc hiệu nhĩm: – Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể) HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 23 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 24 4
5. 31/07/2015 Đặc hiệu tuyệt đối Đặc hiệu tương đối  Enzyme cĩ khả năng Enzyme chỉ tác dụng trên một cơ tác dụng lên một kiểu chất nhất định và hầu như khơng cĩ liên kết hĩa học nhất tác dụng với chất nào khác: định trong phân tử cơ chất mà khơng phụ thuộc vào cấu tạo của Urease các phần tham gia tạo Urea CO2 + 2NH3 H2O thành mối liên kết đĩ CH – O – CO - R CH – O – H HOOC – R Urease 2 1 2 1 CH – O – CO - R CH – O – H + HOOC – R Acetamide Khơng xảy ra 2 2 CH – O – CO – R CH – O – H HOOC – R H2O 2 3 HO - H 2 3 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 25 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 26 Đặc hiệu nhĩm Đặc hiệu quang học  Enzyme cĩ khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hĩa (đặc hiệu lập thể) học nhất định với điều kiện một trong hai phần tham gia tạo thành liên kết phải cĩ cấu tạo xác định: Enzyme chỉ tác dụng một trong hai dạng R’ Carboxyl R’ đồng phân quang học của các chất: peptidase R – C – N – CH R – C – OH + NH2 – CH O H COOH H2O O COOH COOH HO–CH Fumarathydratase CH–COOH R’ Carboxyl peptidase CH –COOH HOOC–CH R – C – N – CH khơng phản ứng 2 H2O L – malic Acid fumaric O H CH2 COOH HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 27 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 28 V. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc Ảnh hưởng của nồng độ enzyme phản ứng enzyme  Nồng độ enzyme Trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc  Nồng độ cơ chất (mơ hình Michaelis – Menten) phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng  Ảnh hưởng của các chất kìm hãm độ enzyme: v=k[E], với k=const  Các chất hoạt hĩa Nhưng khi nồng độ enzyme quá lớn thì  Nhiệt độ vận tốc phản ứng sẽ tăng chậm lại.  pH mơi trường HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 29 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 30 5
6. 31/07/2015 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Ảnh hưởng của các chất kìm hãm (mơ hình Michaelis – Menten)  Phương trình Michaelis – Menten: Chất kìm hãm hay cịn gọi là chất ức chế là những chất mà khi kết hợp với enzyme sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme mà v: vận tốc phản ứng, vmax: vận tốc cực đại của phản nguyên nhân trực tiếp là làm giảm ái lực ứng, [S]: nồng độ cơ chất, Km: hằng số Michaelis giữa enzyme với cơ chất. • [S] > Km: v = vmax hiệu và đặc trưng riêng cho từng enzyme. • [S] = Km: v = vmax/2 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 31 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 32 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm Ảnh hưởng của các chất kìm hãm Dựa vào các hình thức ức chế đặc hiệu, người ta chia thành 2 nhĩm chính:  Tùy theo đặc điểm của mối quan hệ giữa – Ức chế khơng thuận nghịch: enzyme và enzyme và cơ chất, cĩ 2 loại: chất ức chế được liên kết với nhau bằng – Ức chế cạnh tranh: chất ức chế cĩ cấu trúc liên kết đồng hĩa trị và gây nên sự thay tương tự như cơ chất kết hợp ngay vào trung tâm hoạt động của enzyme, chiếm chỗ đổi cấu hình cĩ hoạt tính của enzyme cơ chất phụ thuộc vào tỷ lệ [S]/[I]  tác – Ức chế thuận nghịch: giữa enzyme và động ức chế bằng cách nồng độ cơ chất chất ức chế được liên kết với nhau bằng – Ức chế khơng cạnh tranh: chất ức chế gắn liên kết thứ yếu nào đĩ tạo nên thế cân vào vị trí khác với vị trí gắn cơ chất trên phân bằng thuận nghịch. Sau khi chất ức chế tử enzyme cĩ cấu tạo khác với cơ chất và bị loại trừ, hoạt tính enzyme lại được hồi cĩ thể kìm hãm nhiều loại enzyme khác nhau phục. HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 33 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 34 Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition) E + S ES E + P E + I EI + S EI + S (I là chất ức chế cạnh tranh) HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 35 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 36 6
7. 31/07/2015 Ức chế khơng cạnh tranh Ức chế khơng cạnh tranh  Cĩ 2 dạng: – Noncompetitive inhibition: Khả năng ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ của chất ức chế Các chất ức chế noncompetitive cĩ thể kết hợp cả với enzyme tự do và với phức hệ ES E + I EI – Uncompetitive inhibition: Kiểu ức chế này xảy ra khi một chất ức chế chỉ kết hợp thuận nghịch với phức hệ ES để tạo ra ESI mà sau đĩ khơng thể tạo ra sản phẩm: ES + I ESI HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 37 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 38 Ảnh hưởng của nhiệt độ Ảnh hưởng của các chất hoạt hĩa  Vượt quá phạm vi nào đĩ của nhiệt độ, các phản ứng do enzyme xúc tác sẽ bị ảnh hưởng  Chất hoạt hĩa là những chất cĩ khả năng làm do biến tính của enzyme. tăng hoạt tính xúc tác của enzyme.  Nhiệt độ ứng với hoạt độ enzyme cao nhất gọi là 0  Chất hoạt hĩa cĩ thể là các anion, các ion kim nhiệt độ tối ưu của enzyme (topt)  40 – 50 C, loại nằm ở ơ thứ 11 đến ơ thứ 55 của bảng tuần thay đổi tùy theo cơ chất, pH mơi trường, thời hồn Mendelev hoặc những chất hữu cơ cĩ cấu gian phản ứng tạo phức tạp hơn làm nhiệm vụ chuyển nhĩm,  Nhiệt độ mà enzyme bị mất hồn tồn hoạt tính chuyển hydro hoặc những chất cĩ khả năng phá xúc tác gọi là nhiệt độ tới hạn  700C. Ở nhiệt vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme độ tới hạn, enzyme bị biến tính, ít khi cĩ khả hoặc các chất cĩ tác dụng phục hồi những năng hồi phục lại được hoạt độ. Ngược lại, ở nhĩm chức của trung tâm hoạt động của nhiệt độ dưới 00C, hoạt độ enzyme tuy bị giảm enzyme. nhưng lại cĩ thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ  Tuy nhiên, tác dụng hoạt hĩa chỉ giới hạn ở bình thường những nồng độ xác định, vượt quá giới hạn này  Độ bền nhiệt của enzyme thường tăng lên khi cĩ cĩ thể làm giảm hoạt độ của enzyme cơ chất, coenzyme, Ca2+ HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 39 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 40 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ Ảnh hưởng của nhiệt độ Hoạt độ tương đối, (% hoạt độ cực đại) 100 50 0 20 40 60 80 t(oC) HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 41 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 42 7
8. 31/07/2015 Ảnh hưởng của pH Ảnh hưởng của pH oạt độ tương đối, (% hoạt độ cực đại) Đa số enzyme bền khi pH = 5–9, độ bền H của enzyme cũng cĩ thể tăng lên khi cĩ 100 cơ chất, coenzyme, Ca2+ Mỗi enzyme đều cĩ một pH thích hợp gọi là pHopt  7, nhưng cĩ enzyme cĩ pHopt rất 50 thấp (pepxin, proteinase acid của VSV ) hoặc khá cao (subtilizin, pHopt > 10). pHopt của một enzyme cũng khơng cố định pHopt mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố như cơ 4 5 6 7 8 9 pH chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 43 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 44 Ảnh hưởng của pH Ảnh hưởng của pH Enzyme pHopt Enzyme pHopt Pepsin 1,5 – 2,5 Trypsin 7,8 – 9,5 Saccarase 4,6 – 5,0 Arginase 9,8 (nấm men) Amilase 4,4 – 5,0 Succinate 9,0 (malt) dehydrogenase Amilase 6,8 – 7,2 Catalase 6,8 – 7,0 (nước bọt) Mantase 6,7 – 7,2 Phosphatase ĐV 6,2 – 9,4 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 45 (nấm men) HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 46 VI. Cách gọi tên và phân loại enzyme  Cách gọi tên: – Tên thơng dụng: pepxin, tripxin, kimotripxin – Tên quốc tế: thường gồm 2 phần: • Phần thứ nhất là tên cơ chất (nếu phản ứng lưỡng phân thì phần thứ nhất là tên gọi của 2 cơ chất viết cách nhau bằng hai chấm). • Phần thứ hai: tên phản ứng mà enzyme xúc tác cộng thêm “ase” HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 47 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 48 8
9. 31/07/2015 STT Nhóm chính Phản ứng xúc tác Cách gọi tên và phân loại enzyme của Enzym 1 Oxidoreductase •Chuyển e- , H+ hoặc nguyên tử H) A- + B  A + B-  Phân loại: theo kiểu phản ứng do enzym xúc 2 Transferase •Phản ứng chuyển nhóm chức tác, bao gồm 6 nhĩm chính: A-B + C  A + B - C 3 Hydrolase •Phản ứng phân ly nhờ nước ( thuỷ giải) (chuyển nhóm chức cho phân tử nước) : A-B + H O A-H + – Oxidoreductase (enzyme oxy hĩa khử) 2  – Transferase (enzyme chuyển vị) 4 B-OH Lyase •Phản ứng chuyển hóa nhờ bổ sung nhóm chức vào – Hydrolase (enzyme thủy phân) liên kết đôi hoặc tạo liên kết đôi nhờ lấy đi nhóm chức (phân giải không có nước tham gia) – Lyase (enzyme phân cắt) X Y – Isomease (enzyme đồng phân hĩa)   5 A-B  A=B + X-Y – Ligase (enzyme tổng hợp) Isomerase •Chuyển nhóm chức trong phân tử tạo các dạng đồng phân X Y Y X     6 A-B  A-B HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 49 Ligase •TổngHSTP hợp 1 – Chươngliên kết 3: EnzymeC-C, C-S, C-O và C-N nhờ phản50 ứng trùng ngưng liên hợp với sự thủy giải ATP. 1. Các xác định hoạt tính của VII. CÁC PHƯƠNG PHÁP enzyme NGHIÊN CỨU ENZYME  3 nhĩm phương pháp xác định như sau: 1. Cách xác định hoạt tính enzyme Nhĩm Các thơng số cố định Các thơng số thay đổi 1 Thời gian Biến thiên của S và P 2. Hoạt tính của enzyme Nồng độ enzym 3. Thu nhận enzyme 2 Lượng S mất đi (hay Thời gian lượng P tạo thành) Nồng độ enzym 3 Thời gian Nồng độ E Lượng S mất đi (hay P tạo thành) HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 51 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 52 2. Hoạt tính của enzyme 3. Thu nhận enzyme  Đơn vị quốc tế (UI) là lượng enzyme cĩ khả năng xúc  Enzyme cĩ trong tế bào động – thực vật. Muốn tác làm chuyển hĩa được 1 micromol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn: 1 UI = 1 mol cơ chất/phút thu nhận enzyme cần rút chiết chúng ra khỏi tế  Đơn vị Katal (Kat) là lượng enzyme cĩ khả năng xúc tác bào bằng cách vỡ cấu trúc của tế bào: làm chuyển hĩa được 1 mol cơ chất sau 1 giây ở điều – Nghiền xay với bột thủy tinh, cát thạch anh, kiện tiêu chuẩn: 1 Kat = 1 mol cơ chất/s Đổi đơn vị: 1 UI = 16,67 nKat (nanokatal) xay đồng hố  Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị UI – Dùng dung mơi hữu cơ: butanol, acetone, (hay Kat) ứng với một mililit dung dịch (nếu là chế phẩm glycerin, etyl acetat dạng dung dịch) hay 1 miligam protein (nếu là bột khơ) của chế phẩm. – Bằng sĩng siêu âm  Hoạt độ riêng phân tử là số phân tử cơ chất chuyển hĩa bởi 1 phân tử enzyme trong một đơn vị thời gian HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 53 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 54 9
10. 31/07/2015 3. Thu nhận enzyme Làm tinh Sau chiết tách cĩ thể dùng dung dịch đệm  Loại muối và tạp chất cĩ phân tử lượng nhỏ: thích hợp hoặc muối trung tính chiết rút phương pháp thẩm tích qua màng bán thấm enzyme được dung dịch enzyme + tạp tạp chất cĩ phân tử nhỏ đi qua. chất ( muối, glucid, )  Loại protein lạ và tạp chất cĩ phân tử lượng lớn: phối hợp nhiều phương pháp: sắc ký hấp thụ, Tiến hành tinh sạch để thu được enzyme sắc ký trao đổi ion điện ly, lọc gel, kết tủa phân tinh khiết đọan, biến tính chọn lọc  Kết tủa phân đoạn: dùng muối trung tính (NH4)2SO4, NaCl, Na2SO4, MgSO4 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 55 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 56 Làm tinh Bảo quản  Kết tủa bằng dung mơi hữu cơ: acetone, iso – Bảo quản ở dạng bột khơ sấy chân propanol, etanol, ( nhiệt độ, thời gian ngắn ). khơng ở 30 đến 400C  Sắc ký hấp thụ: thường dùng: hydroxy apatite Bảo quản ở điều kiện khơ, kín, lạnh, tránh làm chất hấp thụ sáng và các tác nhân ảnh hưởng đến hoạt  Sắc ký trao đổi ion: nhựa trao đổi ion tính của enzyme  Dẫn xuất este của celluloza (Carboxyl – metyl – cellulose, dietyl – aminol etyl – cellulose )  Lọc gel: dùng sephadex (dẫn xuất của polysaccharide – dextran ) HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 57 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 58 VIII. Ứng dụng và nguồn thu 1.Protease nhận enzyme 1. Protease 2. Amilase 3. Pectinase Nhĩm protease (peptid – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptid (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin và cũng cĩ khả năng thuỷ phân liên kết ester và vận chuyển acid amin HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 59 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 60 10
11. 31/07/2015 Phân loại Peptidase (Protease) (E.C.3.4)  Protease chia thành 2 loại: endopeptidase và exopeptidase – Endopeptidase: gồm Serine proteinase, Cystein Exopeptidase Endopeptidase proteinase, Aspartic proteinase, Metallo proteinase (E.C. 3.4.11-17) (E.C. 3.4.21-99) – Exopeptidase được phân chia thành 2 loại: Serine proteinase • Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải Aminopeptidase phĩng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một Cystein proteinase tripeptide • Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết Aspartic proteinase peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phĩng Carboxypeptidase ra một amino acid hoặc một dipeptide Metallo proteinase Protease (peptidase) cĩ mã (E.C.3.4) HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 61 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 62 Phân loại Nguồn thu nhận  Ngồi ra, protease được phân loại một cách Nguồn động vật: đơn giản hơn thành ba nhĩm: –Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm – Protease acid: pH 2-4 nhất, lâu dài nhất và – Protease trung tính: pH 7-8 cĩ chứa nhiều enzyme nhất – Protease kiềm: pH 9-11 –Dạ dày bê: thường là renin HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 63 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 64 Nguồn thu nhận Nguồn thu nhận  Nguồn thực vật: Cĩ 3 loại protease thực vật như  Nguồn vi sinh vật: Enzyme protease chủ yếu cĩ ở vi khuẩn, Bromelain (dứa) , Papain (đu đủ) và Ficin (vả) nấm mốc và xạ khuẩn như Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 65 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 66 11
12. 31/07/2015 Ứng dụng của protease -Sợi: đánh bĩng, tách tơ sợi -Thuộc da : làm mềm da, sạch lơng, bĩng da HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 67 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 68 -Sữa: renin, pepsin cĩ khả năng làm -Mỹ phẩm: làm da đơng tụ sữa, ứng tĩc mềm mại, loại bỏ dụng trong sản xuất phomat. tế bào già HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 69 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 70 -Sản xuất nước mắm, nước chấm, tương, - chao, Xà bơng, chất tẩy rửa: tẩy sạch vết máu, sữa trên vải HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 71 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 72 12
13. 31/07/2015 Làm mềm thịt: Với bromelin, papain Thịt tươi thái miếng ngâm vào bromelin, papain 5 – 10 phút nấu bình thường HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 73 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 74 2. Amylase Phân loại Amylase là một loại enzyme cĩ ý nghĩa về  – amylase mặt sinh lý, thương mại và lịch sử cịn gọi là  – amylase diastase  – amylase Amylase cĩ cả ở thực vật lẫn động vật Oligo – 1,6-glucosidase hay dextrinase Amylase thuộc nhĩm enzyme thủy phân, tới hạn xúc tác sự phân giải liên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 75 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 76 Nguồn thu nhận  Amylase cĩ trong tuyến nước bọt hoặc tụy  Ở thực vật, amylase cĩ nhiều trong đại mạch (Hordeum sativum), Lúa (Oryza sativa L.), Ngơ (Zea mays) tạng của động vật HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 77 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 78 13
14. 31/07/2015  Ở VSV, amylase được thu nhận từ: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN Thu nhận, xử – Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm Đại Ngâm Nẩy Sấy lý, làm sạch, mạch mầm khô sợi Aspergillus, Rhizopus phân loại – Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces. Endomycopsy, Không Tách Endomyces Sấy Bảo khí mầm rễ khô quản – Nhiều vi khuẩn cĩ khả năng tạo lượng lớn amylase như: Bac. Polymyxa, Phytomonas Mầm rễ destructans, Bact. cassavanum, Clostridium Malt khô khô acetobutylium, Pseudomonas saccharophila bảo quản – Micromonospora vulgaris 42 cĩ khả năng tạo Các bước quy trình sản Malt khô sản một lượng nhỏ - amylase xuất malt khô xuất bia HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 79 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 80 ỨNG DỤNG AMYLASE TRONG SX CHẤT TẨY RỬA ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE Chất tẩy rửa bao gồm những chất Dựa vào các đặc tính biểu hiện của enzyme amylase người kiềm, sodium silicate, sodium ta tiến hành nghiên cứu phương pháp chuẩn đốn bệnh bicarbonate, sodium tripolyphosphate viêm tuyến tụy Mục đích: loại bỏ các chất vơ cơ, hữu cơ bám vào quần áo như : protein, lipid, Đối tượng: enzyme s-amylase và p- amylase carbohydrate và những chất màu Enzyme -amylase của vi khuẩn là một trong những enzyme thường được ứng dụng trong cơng nghiệp sản xuất chất tẩy rửa HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 81 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 82 ỨNG DỤNG TRONG CƠNG NGHIỆP DỆT RŨ HỒ VẢI -amylase QUÁ TRÌNH RŨ HỒ VẢI THEO PP LIÊN TỤC VỚI ENZYME AMYLASE CHUẨN Dệt: rũ bỏ hồ vải (Tầng lớp hồ để mặt vải trở nên mịn, dễ bắt màu) HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 83 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 84 14
15. 31/07/2015 ỨNG DỤNG TRONG CNSX BIA ỨNG DỤNG TRONG CNSX MÌ CHÍNH Nguyên liệu sử dụng: Ngũ Nguyên liệu sử dụng chủ yếu : Tinh bột sắn, cốc, hoa Houblon, nước, rỉ đường mía Nấm men, chất phụ gia Trong cơng nghệ sản xuất amylase bia, người ta thường sử dụng Tinh bột Dextrin + maltose + glucose emzyme amylase cĩ trong 1000C : 15’ mầm đại mạch  amylase 760C : 15’ Tinh bột Maltose +  Dextrin (Glucogen) Nguyên liệu phụ Gạo và bắp 670C : 60’ Malt ( +Lúa mạch) 520C : 70’ HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 85 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 86 ỨNG DỤNG TRONG CNSX CỒN ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT SIRO Q. trình chuyển hóa tinh bột thành siro fructose Nguyên liệu chứa Sơ đồ Quá tinh bột trình chuyển hóa tinh bột Nấu chín ở t0 cao Amylogluco- Amylase sidase hoạt Làm nguội hoạt động ở động ở 550C 550C Đường hóa HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 87 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 88 ỨNG DỤNG AMYLASE TRONG CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT BÁNH MÌ Sản xuất bánh mì: làm bánh xốp, thơm Trong sản xuất bánh mì, người ta sử dụng ngon hơn cả hai loại enzyme α-amylase và β-amylase tham gia thủy phân tinh bột để tạo thành đường Nhờ đĩ nấm men Saccharomyces cerevisiae sẽ dễ dàng chuyển hĩa chúng thành cồn, CO2, làm tăng thể tích của bánh và tạo ra màu sắc, hương vị tốt cho bánh HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 89 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 90 15
16. 31/07/2015 ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BÁNH KẸO ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT GLUCOSE VÀ MẬT  Mục đích – Làm tăng mùi và vị bánh, khi chế  Chúng ta đã biết từ tinh bột cĩ thể thu được biến bột thành các loại bánh quy các phẩm vật đường khác nhau khi thủy phân các Enzyme protease và amylase tinh bột bằng acid cũng như bằng Enzym của bột hoạt động làm tăng hàm lượng các amino acid tự do và amylase sẽ thu được mật làm tăng lượng đường khử  Mật glucose hay mật maltose thường được – Đường khử và các amino acid tự dùng trong sản xuất bánh kẹo và trong sản do cĩ trong khối bột sẽ cùng tham xuất các sản phẩm ăn kiên cho trẻ em và gia vào các phản ứng oxy_ hĩa người bệnh khử và kết quả tạo cho bánh quy cĩ mùi, vị màu hấp dẫn HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 91 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 92 3. Pectinase Pectin và Pectin cơ chất khác là phức hợp polysaccharides,nĩ gĩp phần làm bền cấu trúc mơ thực vật Pectin cơ chất gồm 2 kiểu: – Homogalacturonan – Heterolacturonan (Rhamnogalacturonan) HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 93 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 94 Pectinases Dựa vào đặc điểm hĩa sinh Pectinases là phức hợp bao gồm Polymethylgalacturonase một nhĩm enzym phân hủy Pectin cơ Polygalacturonases chất Pectin Lyase Phân loại: dựa vào cấu trúc và Polygalacturonates Lyase phương thức của sự tái chế Pectinesterases hoặc Pectinmethylesterase HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 95 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 96 16
17. 31/07/2015 Polymethylgalacturonase Polygalacturonases Hoạt tính PMG được xác định bởi giới hạn sự thủy phân đường của liên kết Thủy phân các liên kết Glycosidis của Glycosidis hoặc sự giới hạn tính dẻo của chất nền. Polygalacturonates bởi 2 cơ chế là endo và exo Đặc điểm hĩa sinh: –Khơng cĩ tính đồng nhất và tiêu biểu Hoạt tính cĩ thể bị giới hạn bởi sự –Hoạt tính khơng điển hình thủy phân đường hoặc phương pháp –pH: 4 – 7 làm giảm tính dẻo –Sự ester hĩa cao: 95% HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 97 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 98 Polygalacturonases Endo – PGs cĩ trọng lượng thay đổi: 30 – 80kDa. Độ đẳng điện: 3,8 – 7,6 pH tối ưu nhất cĩ tính acid: 2,5 – 6,0 Nhiệt độ tối ưu: 30 – 500C Exo – PGs cĩ trọng lượng thay đổi: 30 – 50kDa Độ đẳng điện: 4,0 – 6,0 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 99 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 100 Pectin Lyase Polygalacturonates Lyase Hoạt tính của PL hoạt động cần cĩ  Endo – PGL và exo – PGL làm suy thối Pectate sự hiện diện của Ca2+ bởi trans – elimination bẻ cong 4,5 – Oligomethyl- Phân tử khối của PL khoảng 30 – 40 galacturonates khơng no  PGLs cĩ pH tối ưu: 6 - 10 kDa ngoại trừ trường hợp của PL từ  Trọng lượng phân tử của PGL khoảng 30 – 50 Aureobasidium Pullulans và Pichia kDa ngoại trừ PGL từ Bacteroides và Psuedo- Pinus (~90 kDa) alteromonas (~75 kDa) pH khoảng 4,0 – 7,0 Điểm đẳng điện khoảng 3,5 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 101 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 102 17
18. 31/07/2015 Polygalacturonates Lyase Pectinesterases hoặc Pectinmethylesterase  pH tối ưu khoảng 8 – 10 Pectinesterases chủ yếu cĩ trong  Nhiệt độ tối ưu phổ biến để PGL cĩ hoạt tính là 30 – 400C thực vật như chuối, cam quít và cà  PGL được sản xuất chủ yếu bởi các vi khuẩn gây chua, ngồi ra cịn cĩ trong vi khuẩn bệnh Erwnia, Bacillus và 1 số lồi nấm khác như và nấm Colletotrichum magna, Colletotrichum gloeo Hoạt tính PE tăng khi tăng mức độ Sporiodes, Amylocota sp của sự ester hố chất nền HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 103 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 104 Pectinesterases hoặc Cấu trúc và chức năng của Pectinmethylesterase Pectinases Khối lượng phân tử của PE vi khuẩn, thực vật thay đổi từ 30 – 50 kDa Cấu trúc ba chiều của Pectinase cho phép hiểu đĩ là phân tử cơ bản của pH tối ưu khoảng 4 – 7 enzym  Nhiệt độ tối ưu: 40 – 600C Cấu trúc tinh thể của Pectin bao gồm Độ đẳng điện: 4,0 – 8,0 thành phần của nhiều lớp PE cơng nghiệp cĩ thể sử dụng duy trì cấu trúc; làm bền và làm trong nước trái cây HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 105 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 106 Polygalacturonases Polygalacturonate Lyase Endo – PGL là cấu trúc đảo ngược Tất cả Protein họ PGL cĩ cùng cơ chế của glycosidase nĩ đảo ngược hoạt động enzym tương tự nhau anomeric của sản phẩm trong quá β – elimination chịu sự tác dụng của trình phản ứng pectolytic, dễ bị tách, gồm 3 bước: GalpA ràng buộc cấu trúc bậc ba phức tạp, nhĩm cacboxyl được cơng Sự trung hồ của nhĩm cacboxyl nhận là bảo tồn cấu trúc Sự tách ra của C5 proton Cĩ nhiều trong cà chua chín.Tồn tại Sự di chuyển của proton đến dưới 2 dạng và cả 2 đều là endo – glycosidic oxygen enzym (PG1 và PG2) HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 107 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 108 18
19. 31/07/2015 Pectin Lyase Pectin methylesterase Rãnh PL xuất hiện cùng với phản Pes catalyze pectin bị deester hố ứng đào thải β – elimination như ở bởi hydrolysis giữa α – (1,4) – PGLs methylate và D – galacturonosyl PL là chất nền đặc hiệu cho những Sản phẩm cuối cùng là polymer và mẫu tẩm methylate cao và khơng địi methanol hỏi Ca2+ để hoạt động HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 109 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 110 Ứng dụng Ứng dụng Pectinases kiềm cĩ tiềm tàng những Trong cơng nghiệp: được phân loại ứng dụng: thành 2 kiểu Pectinases acid và Pectinases kiềm –Tẩy vết bẩn trên vải Pectinases acid cĩ những ứng dụng –Cải thiện tính chất sợi thớ rộng rãi: tách và làm trong nước trái –Sự lên men trà và cà phê cây –Cơng nghiệp giấy HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 111 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 112 Pectinase cĩ khả năng thủy phân pectin Sản xuất nước quả từ nguyên liệu quả nhờ cơ chế phá vỡ protopectin ( chất làm liên kết tế bào ), thủy phân protein, phá vỡ nguyên sinh chất của tế bào vỡ tế bào nước chảy ra, hiệu suất tăng. Làm trong nước quả ép ( bia, rượu ) HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 113 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 114 19
20. 31/07/2015 Bảo quản thực phẩm : -Phối hợp với catalase kéo dài thời gian bảo quản của bột trứng, sữa khơ, làm ổn định bia -Chống rỉ các bao bì đựng nước giải khát CO2 ( do đuổi O2 ra khỏi sản phẩm khi thêm nước vào ) HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 115 HSTP 1 – Chương 3: Enzyme 116 20