›
›

Đại cương về phương pháp phân tích sắc ký

pdf 71 trang Gia Huy 25/05/2022 2580
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đại cương về phương pháp phân tích sắc ký", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfdai_cuong_ve_phuong_phap_phan_tich_sac_ky.pdf

Nội dung text: Đại cương về phương pháp phân tích sắc ký

  1. ĐẠI CƯƠNG VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ
  2. CHƯƠNG 19 ĐẠI CƯƠNG VỀ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ 19.1 Định nghĩa – Mục đích 19.2 Phân loại 19.3 Một số khái niệm 19.4 Kỹ thuật tách bằng sắc ký 19.5 Peak sắc ký: các đặc trưng cơ bản 19.6 Độ phân giải của cột 19.7 Kỹ thuật thực nghiệm & ứng dụng 19.8 Tối ưu hĩa quá trình sắc ký
  3. CHƯƠNG 19 ĐẠI CƯƠNG VỀ PP PHÂN TÍCH SẮC KÝ 19.1 ĐỊNH NGHĨA-MỤC ĐÍCH • Định tính Tách • Định lượng • Tinh chế, Hỗn hợp Các cấu tử ΦS φm Mẫu (A,B,C) C B A
  4. CHƯƠNG 19 ĐẠI CƯƠNG VỀ PP PHÂN TÍCH SẮC KÝ 19.2 PHÂN LOẠI – Dựa vào phương tiện tách – Dựa vào trạng thái của φs & φm và cân bằng chuyển chất giữa các pha – Dựa theo cơ chế của quá trình tách – Dựa trên kỹ thuật tách sắc ký
  5. PHÂN LOẠI DỰA VÀO PHƯƠNG TIỆN TÁCH Sắc ký cột Sắc ký giấy Sắc ký bản mỏng (Sắc ký phẳng)
  6. PHÂN LOẠI DỰA VÀO TT CỦA φs & φm VÀ CB CHUYỂN CHẤT GIỮA CÁC PHA PHÂN LOẠI DỰA VÀO TRẠNG THÁI CỦA PHA ĐỘNG Sắc ký khí GC Sắc ký lỏng LC (Gas Chromatography) (Liquid Chromatography ) φm: khí φm: lỏng Tiến hành trên cột Tiến hành trên cột & bản phẳng
  7. PHÂN LOẠI DỰA VÀO TT CỦA φs & φm VÀ CB CHUYỂN CHẤT GIỮA CÁC PHA PHÂN LOẠI DỰA VÀO TRẠNG THÁI CỦA PHA TĨNH Sắc ký Sắc ký Sắc ký HẤP PHỤ Sắc ký TRAO ĐỔI RÂY PHÂN TỬ ION φs: rắn PHÂN BỐ φ : vật liệu rắn φ : nhựa s (chất φs: lỏng s độ xốp lớn cĩ hấp phụ) trao đổi ion các lỗ kích thước xác định
  8. PL THEO CƠ CHẾ CỦA QT TÁCH (Tương tác giữa chất sắc ký với φs & φm ) Sắc ký hấp phụ Sắc ký phân bố
  9. PL THEO CƠ CHẾ CỦA QT TÁCH (Tương tác giữa chất sắc ký với φs & φm ) SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION
  10. PL THEO CƠ CHẾ CỦA QT TÁCH (Tương tác giữa chất sắc ký với của φs & φm ) SẮC KÝ RÂY PHÂN TỬ (Sắc Ký gel)
  11. PL THEO CƠ CHẾ CỦA QT TÁCH (Tương tác giữa chất sắc ký với của φs & φm ) SẮC KÝ RÂY PHÂN TỬ (Sắc Ký gel)
  12. PL THEO KỸ THUẬT TÁCH SẮC KÝ (Dựa trên sự chuyển dịch tương đối của φm so với φs ) PP PP PP TIỀN RỬA ĐẨY LƯU GIẢI
  13. CHƯƠNG 19 ĐẠI CƯƠNG VỀ PP PHÂN TÍCH SẮC KÝ 19.3 MỘT SỐ KHÁI NIỆM – Sắc đồ – Sắc phổ – Sắc ký đồ: * Tích phân * Vi phân
  14. SẮC ĐỒ Các vùng riêng biệt cĩ màu hoặc khơng màu trên cột hoặc trên mặt phẳng sau quá trình tách → kết luận sự hiện diện của các cấu tử trong DD phân tích Thuốc thử VD:dội K [Fe(CN) ] A 3 6 A qua cột cĩ ion Fe2+ sẽ B B làm lớp hấp phụ C C nhuộm màu xanh tối Sắc đồ khơng màu Sắc đồ cĩ màu
  15. SẮC PHỔ Đường biểu diễn sự phân bố nồng độ các cấu tử dọc theo cột hoặc trên mặt phẳng A A B B C C C ( a ) ( b ) ( a ) ( b ) Sắc đồ (a) và sắc phổ Sắc đồ (a) và sắc phổ (b) (b) trong sắc ký cột trong sắc ký phẳng
  16. SẮC KÝ ĐỒ Đường biểu diễn sự phụ thuộc của nồng độ chất đi ra khỏi cột sắc ký theo thể tích dung mơi rửa giải hoặc thời gian rửa giải SẮC KÝ ĐỒ TÍCH PHÂN SẮC KÝ ĐỒ VI PHÂN
  17. SẮC KÝ ĐỒ peak C (sắc ký) C V hay t V hay t Sắc ký đồ tích phân Sắc ký đồ vi phân Trục tung C (tổng nồng Trục tung C hoặc C t độ chất đã đi ra khỏi cột) (nồng độ chất trong từng phân đoạn dung dịch giải hấp)
  18. CHƯƠNG 19 ĐẠI CƯƠNG VỀ PP PHÂN TÍCH SẮC KÝ 19.3 KỸ THUẬT TÁCH BẰNG SẮC KÝ – Phương pháp tiền lưu – Phương pháp đẩy – Phương pháp rửa giải
  19. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN Tín hiệu phát tR hiện tM THỜI GIAN Thời LƯU Sắc ký đồ của hỗn hợp gồm 2 cấu tử cĩ gian GIỮ một cấu tử khơng bị lưu giữ Hiệu tR – tM = tR’ : Thời gian lưu đã hiệu chỉnh
  20. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN Sự chuyển nồng độ chất phân tích X giữa pha động và pha tĩnh: HỆ X(pha động) X(pha tĩnh) (a) SỐ X PHÂN BỐ φS(pha tĩnh) Φm(pha động) HSCB K của (a): hệ số phân bố, đặc trưng cho khả năng lưu giữ
  21. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN CS, CM – nồng độ cấu tử trong pha tĩnh và pha động 3 1 CS HỆ 2 SỐ CS=f(CM ): PHÂN Đường đăng nhiệt BỐ CM Các đường đẳng nhiệt: (1) Henry ; (2) Langmuir ; (3) Freunlich
  22. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN Đường đẳng nhiệt Sắc ký phân bố thường tuyến tính (tuân theo PT Henry): HỆ CS SỐ CS = K CM K C PHÂN M K: hệ số phân bố, đặc trưng BỐ cho khả năng lưu giữ Peak sắc ký đối xứng ( a ) tuyến tính
  23. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN 1. Đường đẳng nhiệt Sắc ký hấp phụ Langmuir HỆ SỐ PHÂN KC M BỐ CS 1 K'CM Peak sắc ký mất đối xứng về bên phải
  24. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN 2. Đường đẳng nhiệt Sắc ký hấp phụ Freunlich HỆ SỐ PHÂN n BỐ CS KCM ( c )Freunlich Peak sắc ký mất đối xứng về bên trái
  25. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN L – chiều dài của pha tĩnh nhồi trong cột L Vận tốc di chuyển tuyến V tính trung bình của cấu tử: t VẬN R TỐC Vận tốc di chuyển tuyến L tính trung bình của pha u DI t CHUYỂN động: M 1 v u VS 1 K X VM VM , VS : thể tích của pha động, tĩnh (ml)
  26. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN ' K XVS HỆ k X VM SỐ CHỨA t t k ' R M Hoặc: X (Dung tM Lượng Cột) Giá trị hệ số chứa tối ưu: từ 1 đến 5
  27. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN α đặc trưng cho khả năng phân tách các cấu tử khác nhau trong hỗn hợp k/sát HỆ Hệ số α của cột đối với K SỐ B 2 cấu tử A và B: K A CHỌN KA, KB–hệ số phân bố của cấu tử A và cấu tử B LỌC (cấu tử B bị lưu giữ mạnh hơn so với cấu tử A , α tức > 1) C B S A CM B A
  28. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN K V (t ) t k ' A S R A M A t HỆ VM M SỐ ' K BVS (tR )B tM kB CHỌN VM tM LỌC k' (t ) t α Suy ra B R B M k'A (tR ) A tM Từ hệ số chọn lọc α và hệ số chứa sẽ xác định được độ phân giải của cột
  29. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN Theo thuyết đĩa (Do Martin và Synge đề nghị 1942) Hiệu năng của cột sắc ký được đánh HIỆU NĂNG giá thơng qua hai đại lượng : CỦA (1) chiều cao đĩa lý thuyết H CỘT (2) số đĩa lý thuyết N SẮC L KÝ N H L – chiều dài của chất nhồi trong cột, cm N càng lớn: cột càng hiệu nghiệm
  30. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN Theo thuyết đĩa XĐ H và N bằng thực nghiệm C q Cmax Điểm uốn h’ HIỆU P r h tM P’ r’ NĂNG ½ WA CỦA O WA CỘT m n S SẮC (tR)A KÝ Diện tích của hình tam giác đáy W bằng 96% t tổng diện tích giới hạn bởi đường cong, tương đương với diện tích được giới hạn bởi 2 đường ± 2σ với W ≈ 2 PR ≈ 4 μ
  31. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN Theo thuyết đĩa XĐ H và N bằng thực nghiệm LW 2 H 2 HIỆU 16t R NĂNG t CỦA N 16( R ) 2 CỘT W SẮC t KÝ N 5,54( R ) 2 Hoặc: W1/ 2
  32. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN Theo thuyết tốc độ Phương trình Van Deemter: HIỆU NĂNG CỦA B CỘT H H H H A Cu SẮC A B C u KÝ
  33. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN PT Van Deemter: Theo thuyết tốc độ B H H H H A Cu A B C u HIỆU NĂNG HA – chiều cao riêng phần thể hiện chất CỦA lượng cột nhồi: CỘT A = 2 λ d SẮC p KÝ λ phụ thuộc vào kích thước hạt và mức độ đồng nhất khi nạp cột ( λ=1 khi kích thước hạt 0,4 – 0,8mm); dp–đường kính hạt chất hấp phụ, cm.
  34. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN PT Van Deemter: Theo thuyết tốc độ B H H H H A Cu A B C u HIỆU NĂNG HB – chiều cao riêng phần biểu diễn sự CỦA phân tán của cấu tử khảo sát trong CỘT pha động: SẮC B = 2 γ D KÝ M γ–hệ số phụ thuộc vào khoảng cách giữa các hạt (γ ≈ 0,6 – 0,8); DM – hệ số khuếch tán trong pha động, cm2s–1
  35. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN PT Van Deemter: Theo thuyết tốc độ B H H H H A Cu A B C u HIỆU HC – chiều cao riêng phần biểu diễn sự hấp NĂNG phụ/ giải hấp phụ của cấu tử trên φS và sự CỦA phân tán của cấu tử trong hai pha: 2 CỘT d f C CS CM const SẮC DS KÝ df–bề dày của lớp phủ lỏng trên pha tĩnh, cm; 2 –1 DS–hệ số khuếch tán trong pha tĩnh, cm s ; const–hằng số đặc trưng cho QT chuyển khối: 8 k' Với k’ – hệ số chứa const 2 (1 k')2 u–vận tốc của pha động
  36. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN Theo thuyết tốc độ PT Van Deemter 2 2DM d f H 2d p const u HIỆU được viết lại đầy u DS NĂNG đủ: H CỦA CỘT Đường H= f(u) có SẮC dạng hyperpol: KÝ I Hopt Hmin u uopt Sự phụ thuộc của H vào vận tốc pha động u
  37. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN Theo thuyết tốc độ Hiệu năng của cột đạt giá trị cực đại tại điểm I với u và H HIỆU opt opt NĂNG H CỦA Giá trị Hopt xảy ra tại CỘT B SẮC u opt C KÝ I Hopt Hmin u uopt H opt A 2 BC
  38. PEAK SẮC KÝ: CÁC ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN H opt A 2 BC B H H H H A Cu A B C u HIỆU NĂNG Đại lượng A khơng phụ thuộc vào u CỦA - u quá lớn/ quá bé đều làm giảm hiệu năng: CỘT + u lớn làm cho thành phần thứ ba rất lớn, SẮC hiệu năng của cột kém do QT trao đổi chất KÝ xảy ra khơng kịp + u quá bé làm cho B/u rất lớn (peak bị giãn rộng)
  39. CHƯƠNG 19 ĐẠI CƯƠNG VỀ PP PHÂN TÍCH SẮC KÝ 19.6 ĐỘ PHÂN GIẢI CỦA CỘT RS
  40. ĐỘ PHÂN GIẢI CỦA CỘT RS RS biểu thị khả năng tách hai cấu tử A,B ra khỏi nhau: (t ) (t ) 2 t Δt R R B R A R R S W W W W A B A B A 2 2 B (27) 1/2 WA 1/2 WB σA σA σB σB tM WA WB (tR)A (tR)B Sắc ký đồ của 2 cấu tử A,B với độ phân giải RS ≈ 1,5
  41. ĐỘ PHÂN GIẢI CỦA CỘT RS RS = 0,75: hai peak khơng tách được RS = 1: hai peak chồng lấp ≈ 4% ; RS =1,5: hai peak chồng lấp ≈ 0,3% (A và B được xem là tách hồn tồn nếu RS ≥ 1,5 ) RS = 0,75 RS = 1,0 Quá trình tách 2 peak với RS = 1,0 và RS = 0,75 Cĩ thể tăng RS của một pha tĩnh cho trước bằng cách tăng L nhưng cần lưu ý rằng thời gian tách cũng sẽ tăng lên
  42. CHƯƠNG 19 ĐẠI CƯƠNG VỀ PP PHÂN TÍCH SẮC KÝ 19.7 KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM & ỨNG DỤNG – Thiết bị phân tích sắc ký: *Bộ nạp mẫu *Cột sắc ký *Detector – Phân tích định tính và định lượng – Tối ưu hĩa quá trình sắc ký
  43. THIẾT BỊ PHÂN TÍCH SẮC KÝ Mẫu được bơm bằng các syringe (thể tích từ một phần mười đến Kim BỘ tiêm vài chục μL) Buồngm NẠP bay hơi Khí mang MẪU Cột Bộ nạp mẫu lỏng dùng cho sắc ký khí
  44. THIẾT BỊ PHÂN TÍCH SẮC KÝ Thẳng hoặc xoắn, bằng thép, đồng, thủy tinh nĩng chảy cĩ độ bền nhiệt và bền hố học cao CỘT SẮC L : vài cm đến cả trăm mét KÝ Φ cột: - Vài cm đ/v cột nhồi - Từ 0,10–0,5mm đối với cột mao quản
  45. THIẾT BỊ PHÂN TÍCH SẮC KÝ CỘT SẮC KÝ Df Polyimide (Nhơm) ID 0.1-0.53mm Lớp pha tĩnh L Fused silica(silicon dioxide) Cột mao quản phim mỏng (WCOT) 2-4 mm Wall-coated open-tubular column Cột mao quản lớp mỏng (SCOT) Support-coated open-tubular column Cột nhồi Cột mao quản nhồi
  46. THIẾT BỊ PHÂN TÍCH SẮC KÝ Các chất nhồi trong cột phải tách tốt, bền cơ, bền hĩa (thường dùng oxyd nhơm, silicagel, than hoạt tính, các polymer xốp và zeolite tổng hợp ) CỘT SẮC Cột cĩ thể được lắp trong lị nung để thực KÝ hiện quá trình tách ở nhiệt độ cao theo một chương trình nhiệt độ cài đặt sẵn Trong SK giấy, SK bản mỏng, “cột sắc ký” là giấy/ bản mỏng được phủ một lớp pha tĩnh
  47. THIẾT BỊ PHÂN TÍCH SẮC KÝ Phát hiện thành phần các chất đi qua cột (khí hoặc DD ) thơng qua độ dẫn nhiệt, độ dẫn điện, theo ngọn lửa, ngọn lửa ion hĩa, chỉ số khúc xạ, khối lượng cấu tử được tách DETECTOR Khả năng của detector được đánh giá (đầu dị) thơng qua độ nhạy, giới hạn phát hiện, quán tính và phạm vi tuyến tính giữa nồng độ và độ lớn của tín hiệu. Detector ngày nay thường làm việc theo kiểu vi phân (kiểu tích phân ít được sử dụng do quán tính cao và độ nhạy thấp)
  48. Các loại Detector sắc ký khí thơng dụng TCD FID Nhận tín hiệu Ngọn lửa ++ + Hidro+ Điện cực Khơng điện áp cao khí Cột sắc ký khí và khí bổ trợ Thermal conductivity detector Flame Ionization Detector)
  49. PT ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Định tính trong sắc ký đơn giản N Dựa chủ yếu vào vị trí cấu tử trên pha tĩnh M X’ X PHÂN Dung mơi O TÍCH Với PP sắc ký phân bố, Sắc ĐỊNH cịn cĩ thể dựa vào R ký f x OM TÍNH (hằng số phân bố vùng) R f x' ON O–điểm xuất phát M–điểm cĩ nồng độ cấu tử đạt cực đại. N–v ị trí ứng với đoạn di chuyển cực đại của dung mơi
  50. PT ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Định tính trong sắc ký hiện đại tR PHÂN tM TÍCH ĐỊNH TÍNH So sánh thời gian lưu tương đối tR giữa các cấu tử và các chuẩn (thực hiện độc lập hoặc thêm chuẩn vào DD mẫu)
  51. PT ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Định lượng trong sắc ký đơn giản A B Sắc ký cột: phân tích từng C PHÂN phần DD được hứng ở cuối cột TÍCH ĐỊNH LƯỢNG Sắc ký phẳng: đo diện tích các A vết màu của mẫu và chuẩn B sau khi tách và hiện màu C
  52. PT ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Định lượng trong sắc ký hiện đại ΔtR A PHÂN B TÍCH ĐỊNH 1/2 WA 1/2 WB σA σA σB σB LƯỢNG tM WA WB (tR)A (tR)B Định lượng dựa vào chiều cao h hoặc diện tích S của peak
  53. PT ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Định lượng trong sắc ký hiện đại Dựa vào chiều cao peak h PHÂN Nối đường nền giữa hai chân của peak TÍCH bằng một đường thẳng và đo chiều cao h ĐỊNH của peak từ đường nền này LƯỢNG Chỉ nên sử dụng PP đo chiều cao khi bề rộng của peak mẫu và peak chuẩn hồn tồn bằng nhau
  54. PT ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Định lượng trong sắc ký hiện đại Dựa vào diện tích peak S: PP % diện tích SB S SA C PHÂN TÍCH ĐỊNH A B C LƯỢNG %SA , %SB và %SC chính là %A, %B và %C trong hỗn hợp PP này ngày nay ít được dùng vì rất kém chính xác
  55. PT ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Định lượng trong sắc ký hiện đại Dựa vào diện tích peak S: % diện tích được chuẩn hĩa theo hệ số hiệu chỉnh Để hiệu chỉnh sự khác nhau về độ nhạy của detector đối với các cấu tử, pha chế PHÂN TÍCH mẫu chuẩn chứa các cấu tử tinh khiết cĩ ĐỊNH thành phần bằng nhau LƯỢNG (SB)Ch (SC)Ch (SA)Ch Chọn một trong các cấu tử (thường cĩ diện tích peak lớn nhất) làm chuẩn, (Khc =K0 =1)
  56. PT ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Định lượng trong sắc ký hiện đại Dựa vào diện tích peak S: % diện tích được chuẩn hĩa theo hệ số hiệu chỉnh Hệ số hiệu chỉnh K của cấu tử i trong mẫu: PHÂN i TÍCH S R Ki ĐỊNH (Si )chuan LƯỢNG SR –diện tích của peak chuẩn; (Si)chuan – diện tích của peak cấu tử i trong mẫu chuẩn
  57. PT ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Định lượng trong sắc ký hiện đại Dựa vào diện tích peak S: % diện tích được chuẩn hĩa theo hệ số hiệu chỉnh PHÂN Cấu tử i trong mẫu thật cĩ diện tích Si. TÍCH Hiệu chỉnh S theo độ nhạy của dectector: ĐỊNH i LƯỢNG Si (hiệu chỉnh) = Si . Ki
  58. PT ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Định lượng trong sắc ký hiện đại Dựa vào diện tích peak S: % diện tích được chuẩn hĩa theo hệ số hiệu chỉnh Nếu khối lượng của cấu tử i và cấu tử chuẩn PHÂN khơng bằng nhau thì K được tính: TÍCH i SR Gi K i K 0 ĐỊNH (Si )chuan GR LƯỢNG Gi,GR–khối lượng của cấu tử i và cấu tử chuẩn; K0–hệ số hiệu chỉnh của cấu tử chuẩn % của cấu tử i trong dd chứa ba cấu tử A, B, C: S K 100% % cấu tử i = i i S A K A S B K B SC K C
  59. PT ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Định lượng trong sắc ký hiện đại Dựa vào diện tích peak S: PP chuẩn ngoại Lập đường chuẩn diện tích peak S theo PHÂN nồng độ C của cấu tử khảo sát TÍCH ĐỊNH Chọn điều kiện thích hợp để quan hệ giữa LƯỢNG S và C tuyến tính Định lượng cấu tử khảo sát bằng đồ thị hoặc PP bình phương cực tiểu
  60. PT ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Định lượng trong sắc ký hiện đại Dựa vào diện tích peak S: PP chuẩn ngoại S PHÂN TÍCH ĐỊNH S LƯỢNG m SC2 SC1 CC1 CC2 C Cm
  61. PT ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Định lượng trong sắc ký hiện đại Dựa vào diện tích peak S: PP chuẩn ngoại Việc bơm mẫu địi hỏi độ lặp cao thực ra PHÂN rất khĩ thực hiện vì lượng mẫu đưa vào TÍCH máy là rất ít để tránh cho cột khơng bị ĐỊNH quá tải LƯỢNG Mẫu được bơm vào máy cịn cĩ khả năng bị thất thốt do bay hơi, nhất là khi bộ nạp mẫu đang ở nhiệt độ cao
  62. PT ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Định lượng trong sắc ký hiện đại Dựa vào diện tích peak S: PP chuẩn nội Nhằm hiệu chỉnh sai số do bơm mẫu PHÂN khơng lặp lại: TÍCH -Thêm vào mẫu một chất chuẩn cĩ nồng ĐỊNH độ biết trước được gọi là chất nội chuẩn LƯỢNG Chất nội chuẩn cĩ thể cĩ tính chất hĩa lý rất gần với cấu tử khảo sát hoặc cũng cĩ thể chính là một cấu tử nào đĩ cĩ mặt trên sắc ký đồ
  63. PT ĐỊNH TÍNH & ĐỊNH LƯỢNG Định lượng trong sắc ký hiện đại Dựa vào diện tích peak S: PP chuẩn nội Nếu chất nội chuẩn khơng phải là thành phần của hỗn hợp phân tích thì thành PHÂN phần khối lượng của cấu tử khảo sát được TÍCH tính theo cơng thức: S K m ĐỊNH % cấu tử i = i i R .100 LƯỢNG SR K R mmau mR – khối lượng chất nội chuẩn thêm vào mẫu; mmau – khối lượng của mẫu Độ chính xác của PP khơng phụ thuộc vào độ lặp lại của quá trình bơm mẫu
  64. CHƯƠNG 19 ĐẠI CƯƠNG VỀ PP PHÂN TÍCH SẮC KÝ 19.8 TỐI ƯU HĨA QT SẮC KÝ – Ảnh hưởng của k’ và α lên độ phân giải RS của cột – Ảnh hưởng của RS đến thời gian lưu giữ
  65. TỐI ƯU HĨA QT SẮC KÝ Tối ưu hĩa là tìm các điều kiện để đạt được RS cao trong thời gian chấp nhận được, hoặc đạt được thời gian ngắn nhất ứng với RS đạt yêu cầu (các peak tách hồn tồn ra khỏi nhau) Muốn đánh giá khả năng tách của cột (hay lớp mỏng) phải xem xét đồng thời hiệu năng của cột, độ chọn lọc, độ tách và (xem xét H, α , RS và k’)
  66. TỐI ƯU HĨA QT SẮC KÝ Giả thiết bề rộng W chân các peak khác nhau khơng đáng kể ẢNH HƯỞNG 2 2 k'B 1 2 N 16RS ( ) ( ) CỦA 1 k'B k’ VÀ Thời gian phân tích sắc ký được xác định α dựa vào vận tốc của cấu tử di chuyển chậm LÊN nhất. Nếu cấu tử đĩ là B: RS 2 3 16RS H 2 (k'B 1) CỦA (t R ) B ( ) 2 u 1 (k' ) CỘT B
  67. TỐI ƯU HĨA QT SẮC KÝ Khi tiến hành tối ưu hĩa, phải luơn luơn nhớ rằng α và k’ khơng thay đổi khi N,H (hoặc L) thay đổi và ngược lại Biện pháp thay đổi các thơng số: Thay đổi α và k’: thay đổi nhiệt độ hoặc thành phần của φM . Thay đổi φS cũng đạt mục đích nhưng bất tiện hơn Thay đổi N bằng cách thay đổi L; thay đổi H bằng cách thay đổi u, kích thước hạt của pha tĩnh, độ nhớt của pha động (để làm thay đổi DM, DS) và bề dày của lớp phim lỏng trên bề mặt pha tĩnh
  68. TỐI ƯU HĨA QT SẮC KÝ VÍ DỤ: Dùng cột cĩ L = 30,0 cm tách A và B đo được (TR)A=16,40 và (TR)B =17,63 phút; WA=1,11 và WB = 1,21phút. Hãy xác định: (a) RS của cột (b) N trung bình của cột; (c) Chiều cao đĩa H ; (d) L địi hỏi để đạt độ phân giải là 1,5; (e) thời gian rửa giải cấu tử B trên cột dài hơn; (f) chiều cao đĩa lý thuyết để đạt độ phân giải 1,5 trên cột 30,0 cm với cùng thời gian lưu. Cho biết tM = 1,30 phút
  69. TỐI ƯU HĨA QT SẮC KÝ 2(17,63 16,40) phut (a) Áp dụng PT (27): R 1,06 S (1,11 1,21) phut (b) Áp dụng PT (21) : 16,40 17,63 N 16( ) 2 3,49.103 và N 16( ) 2 3,40.103 1,11 1,21 3 Suy ra Ntb = 3,44.10 (c) Chiều cao đĩa lý thuyết H: L 30 H 8,72.10 3 cm N 3,44.103
  70. TỐI ƯU HÓA QT SẮC KÝ (d) k’ và α khơng thay đổi khi tăng N và L. Do đĩ, thay thế N1, N2 vào (30) và lập tỷ số : 3 (R ) N1 1,06 3,44.10 S 1 ↔ (R ) S 2 N 2 1,50 N 2 3 Suy ra : N2 = 6,89.10 Chiều dài cột để độ phân giải tăng lên 1,5: – 3 3 L2 = H x N = 8,72.10 x 6,89.10 = 60,0 cm
  71. TỐI ƯU HÓA QT SẮC KÝ (e) Thay thế (RS)1, (RS)2 vào (32) và lập tỷ số, ta cĩ: 2 (t ) (R ) 2 17,63 (1,06) R 1 S 1 2 ↔ (t ) 2 (t R ) 2 (RS ) 2 R 2 (1,50) Suy ra (tR)2 = 35,3 phút (f) Thay thế H1, H2 vào PT (32) và lập tỷ số , ta cĩ: 2 (tR )B (RS )1 H1 2 x (t ) (R ) H (R )2 (1,06)2 R B S 2 2 H H S 1 8,72.10 3 4,3.10 3 cm ↔ 2 1 2 2 (RS )2 (1,50)