Đường truyền lây và mô đích tấn công của vi khuẩn flavobacterium columnare trên cá Tra (pangasianodon hypophthalmus)

Nội dung text: Đường truyền lây và mô đích tấn công của vi khuẩn flavobacterium columnare trên cá Tra (pangasianodon hypophthalmus)

1. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II ĐƯỜNG TRUYỀN LÂY VÀ MÔ ĐÍCH TẤN CÔNG CỦA VI KHUẨN Flavobacterium columnare TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Nguyễn Ngọc Du1*, Nguyễn Thị Tuyết Mai2, Mã Tú Lan1, Lê Thị Bích Thuy3, Đoàn Văn Cường1 TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định đường truyền lây của vi khuẩn Flavobacterium columnare trên cá tra giai đoạn cá hương. Phương pháp ngâm cho tỷ lệ chết cao nhất (86,6 - 100%) ở nồng độ cảm nhiễm từ 2,5 x 103 - 104 CFU/mL. Phương pháp tiêm cho tỷ lệ chết từ 56,6 - 100% ở nồng độ cảm nhiễm 2,5 x 105 - 106 CFU/cá. Ở phương pháp cho tiếp xúc cá bệnh - cá khỏe với tỷ lệ 10%, 20%, 30% tổng số nhóm cá thí nghiệm, tỷ lệ cá chết từ 11 - 45%. Không ghi nhận cá chết khi cảm nhiễm bằng phương pháp cho ăn. Phân tích mô bệnh học thể hiện vi khuẩn bám nhiều trên lớp nhớt tiết bên ngoài da vùng đuôi và phần cơ bị hoại tử. Phân tích các mẫu mô thu từ cá bệnh bằng kỹ thuật PCR cũng cho thấy mô đích tác động của vi khuẩn F. columnare trên cá tra được xác định là cơ đuôi và mang. Ngoài ra vẫn có sự hiện diện của vi khuẩn này trên mô thận với tỷ lệ và cường độ nhiễm thấp hơn, tuy nhiên không phát hiện vi khuẩn ở mô gan. Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn gây bệnh ở các mô có sự tương đồng giữa phương pháp ngâm với cá bệnh tự nhiên nhưng có sự khác biệt giữa phương pháp tiêm và cá bệnh tự nhiên (p < 0,05). Kết quả trên cho thấy cơ chế tấn công của vi khuẩn là từ bên ngoài vào, gây tổn thương các cơ quan bên ngoài (đuôi và mang), trong đó phần cơ đuôi dễ bị tổn thương nhất, sau đó mới xâm nhiễm vào các cơ quan nội quan. Từ khóa: Flavobacterium columnare, cá tra, đường truyền lây, mô đích. I. ĐẶT VẤN ĐỀ columnare cũng gây bệnh ở nhiều loài cá cảnh Trong nghề nuôi cá da trơn ở Mỹ, nhiệt đới như cá molly (Poecilia sphenops), cá Flavobacterium columnare là vi khuẩn phổ platie (Xiphophorus maculatus) (Decostere và biến thứ hai, sau Edwardsiella ictaluri (Hawke ctv., 1998), cá da trơn Brazil và cá rô phi sông & Thune, 1992), gây tổn thất hàng năm lên đến Nile (Barony và ctv., 2015). Bệnh columnaris 30 triệu USD (Shoemaker và ctv., 2011). Trong được cho là nguyên nhân gây tổn thất nhiều suốt hai thập kỷ gần đây, bệnh columnaris cũng nhất ở các trang trại nuôi cá da trơn ở bang là mối đe dọa lớn nhất cho nghề nuôi cá hồi Đại Mississippi, Mỹ vào năm 2000. Khoảng thời Tây Dương (Salmo salar), cá hồi nâu (Salmo gian từ năm 2004 - 2007, tỷ lệ thiệt hại do bệnh trutta), cá hồi Thái Bình Dương (Oncorhynchus columnaris chiếm 18,33% (Cunningham và ctv., mykiss) ở vùng Fennoscandia, Phần Lan. Vi 2012). khuẩn này cũng được coi là tác nhân gây bệnh Bệnh do Flexibacterium columnaris lần quan trọng trong nghề nuôi cá rô phi ở Brazil. F. đầu được công bố vào năm 1922 và được xem 1 Viện Nghiện cứu Nuôi trồng Thủy sản II 2 Trường Đại học Quốc tế Tp. Hồ Chí Minh 3 Trường Trung cấp Kỹ thuật Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh * Email: ngocduaqua@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 61
2. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II là mối đe dọa nghiêm trọng đối với cá tự nhiên và ctv., 2008). Ở Canada, bệnh do F. columnare và cá nuôi. Năm 1944, Ordal và Rucker lần cũng được ghi nhận ở cá hồi trắng (Coregonus đầu tiên phân lập được vi khuẩn này từ ổ dịch clupeaformis) với những biểu hiện bệnh tích trên cá hồi đỏ (Onchorhynchus nerka) ngoài tự như: các vùng nhạt màu trên cơ thể từ từ bị nhiên. Đến năm 1996, vi khuẩn này được đổi tróc da và lở loét, các sợi mang bị hoại tử. Mẫu tên thành Flavobacterium columnare và được soi tươi vùng hoại tử của da và mang có nhiều sử dụng cho đến nay. Vi khuẩn F. columnare vi khuẩn hình sợi chuyển động trượt (Scott & được tìm thấy chủ yếu trên các loại cá nước Bollinger, 2014). F. columnare hiện diện nhiều ngọt. Đối với những trường hợp cấp tính, bệnh ở da và vây của cá koi bệnh do cảm nhiễm thực do Flavobacterium có khả năng gây chết lên nghiệm, không thường xuyên thấy ở mang, và ít đến 70%, hoặc có thể đến 100% (Suomalainen khi phân lập được ở các cơ quan khác như gan, và ctv., 2005). Những cá sống sót tăng trưởng thận, lách (Tripathi và ctv., 2005). Tuy nhiên, rất kém, cơ và vây bị ăn mòn và hoại tử, khung trong tự nhiên, biểu hiện hoại tử mang là dấu xương bị biến dạng sau một thời gian dài nhiễm hiệu thường thấy nhất khi dịch bệnh columnaris bệnh (Austin & Austin, 1999). Các chủng vi xảy ra, làm cho cá chết trước khi xuất hiện khuẩn có độc lực khác nhau có sự liên quan những dấu hiệu lở loét trên da (Decostere và với khả năng bám dính vào mang cá và những ctv., 2002). Vi khuẩn F. columnare chủ yếu được yếu tố môi trường cũng có ảnh hưởng đến khả quan sát ở lớp biểu bì, vùng bong tróc hoặc lở năng bám dính này (Decostere, 2002). Đây là loét ở cá nheo (Ictalurus punctatus) và cá ngựa bước quan trọng trong quá trình phát sinh bệnh vằn (Danio rerio) (Bullard và ctv., 2011). Ngoài (Decostere và ctv., 1999). Cá nheo Mỹ 4 tháng ra, vi khuẩn còn được thấy nhiều ở mang và phần tuổi gây nhiễm thực nghiệm với các chủng F. gốc đuôi trên các loài cá nước ngọt như cá chép columnare 94-081 và Matt gây chết từ 87% đến (Cyprinus carpio), cá hồi vân (Oncorhynchus 100%, ở cá 6 tháng tuổi tỷ lệ chết lên đến 60% mykiss) (Declercq và ctv., 2015), cá mang xanh trong vòng 8 ngày. Đối với những chủng 143- (Lepomis macrochirus) (Bullard và ctv., 2013). 94 và C56-1 mang độc lực thấp, có khả năng Phân tích sự hiện diện của F. columnare bằng gây chết cá với tỷ lệ thấp hơn (dưới 40%). Cá kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) bị tuột nhớt, có dấu hiệu lở tróc trên da hoặc trên các mô cá có biểu hiện mang nhợt nhạt, không. Dấu hiệu tuột nhớt càng cao, tỷ lệ cá đuôi mòn, da mất màu, tuột nhớt, cá mất thăng chết càng tăng (Soto và ctv., 2008). Ở cá tra bằng ở một số loài cá nước ngọt nuôi ở vùng (Pangasianodon hypophthalmus), liều gây chết Mymensingh (Bangladesh), West Bengal (Ấn 5 50% (LD50) trên cá giống từ khoảng 4 x 10 - 1,6 Độ), Lembuchera, Tripura (Ấn Độ) cho thấy F. x 106 CFU/mL (Tien và ctv., 2012) bằng phương columnare chủ yếu tìm được ở mang và cơ, một pháp ngâm. Thí nghiệm cũng gây chết 100% ở số trường hợp có ở thận và lách (Patra và ctv., nồng độ 2 x 105 - 2 x 107 CFU/mL ở cá rô phi 2016). (Dong và ctv., 2016). F. columnare có thể lây truyền thông qua Trên cá nhiệt đới nuôi ở Brazil, F. columnare môi trường nước và bùn đất trong ao nuôi. Bệnh cũng được phân lập ở những cá có vùng da bị columnaris xảy ra khắp mọi nơi và vi khuẩn mất màu, tạo đốm màu trắng xám ở một số xâm nhiễm vào tất cả các loài cá nước ngọt và phần trên cơ thể như đầu, miệng, mang, vây và một số loài lưỡng cư. Cá hồi giống, cá da trơn thân, được bao quanh bởi vùng đỏ nhẹ do da giống nuôi ở các trại sản xuất thường rất dễ bị bị tróc, đuôi bị ăn mòn, da bị lở loét (Pilarski bệnh columnaris do được nuôi với mật độ cao, 62 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
3. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II trong đó yếu tố môi trường là điều kiện quan ngoài khỏe mạnh, được nuôi thuần ít nhất 1 trọng gây phát sinh dịch bệnh. Khi kết hợp với tuần trước khi thí nghiệm trong bể composite. các yếu tố gây sốc như nhiệt độ tăng, mật độ Cá được kiểm tra không nhiễm mầm bệnh F. tăng, xây xát do vận chuyển , F. columnare có columnare bằng cách phết lam từ nhớt da bên thể tấn công và gây bệnh cho cá. Các nghiên ngoài để kiểm tra vi khuẩn và cấy nhớt cá trên cứu cho thấy F. columnare có thể lây truyền trực môi trường TYES (Trypton Yeast Extract Salts). tiếp từ cá sang cá thông qua môi trường nước Đồng thời, các mầm bệnh quan trọng khác nhưng quá trình phát bệnh có liên quan đến các (Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri) điều kiện gây sốc như chất lượng nước kém, là những tác nhân gây bệnh phổ biến trên cá tra di chuyển cá trong quá trình thả giống hay thu cũng được kiểm tra bằng cách cấy mẫu thận trên hoạch. F. columnare có thể tạo thành dạng kén môi trường thạch máu. (microcyst) tồn tại nhiều năm và đây có thể là 2.1.2. Chuẩn bị vi khuẩn cảm nhiễm nguồn lây nhiễm tự nhiên. Vi khuẩn có khả năng Chủng vi khuẩn F. columnare AG.07.19_8 sống sót hàng tháng trong nước hồ đã được vô được phân lập từ mẫu cá bệnh trắng đuôi, thối trùng và có thể sống trên những mô cá chết. đuôi thu ở An Giang và lưu giữ chủng ở nhiệt Hơn nữa, F. columnare có thể di chuyển rất hiệu độ -80ºC. Vi khuẩn được cấy trên đĩa môi trường quả từ cá chết sang cá sống, thậm chí còn nhanh TYES ủ ở 30ºC trong 48 giờ. Khuẩn lạc đơn được hơn từ cá sống sang cá sống. Khả năng này làm cấy chuyển sang nuôi trong môi trường TYES gia tăng sự phát sinh bệnh tiềm ẩn khi thay đổi lỏng ở 30ºC trong vòng 24 giờ để huyền dịch vi môi trường sống của cá. Thời gian ủ bệnh của F. khuẩn gốc đạt khoảng 108CFU/mL. Vi khuẩn columnare có thể thay đổi tùy theo độc lực của được pha loãng thành các nồng độ 2,5 x 106, 5 chủng và điều kiện của môi trường. Chủng có x 106, 107 CFU/mL và sẵn sàng cho cảm nhiễm. độc lực cao có thể gây dịch bệnh cấp tính trong 2.2. Cảm nhiễm xác định đường truyền lây vòng 24 giờ, trong khi chủng có độc lực thấp có Thực hiện thăm dò các đường truyền lây: thể cần nhiều thời gian hơn, từ 48 giờ cho đến ngâm trong nước, tiêm, cho ăn, tiếp xúc cá vài tuần (Warren, 1981). bệnh- khỏe. Nghiên cứu này được thực hiện trên cá tra Mỗi đường truyền lây được thực hiện ở 3 dưới 2 tháng tuổi vì đây là giai đoạn mẫn cảm nồng độ và lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố của cá tra đối với tác nhân gây bệnh trắng đuôi, trí trong các bể nhựa, mỗi bể chứa 20 con. Ở thối đuôi. Việc xác định được đường truyền lây nghiệm thức ngâm, cá được ngâm trong bể 1 của vi khuẩn vào cơ thể vật chủ nhằm hạn chế lít nước có chứa vi khuẩn nồng độ 2,5 x 103, khả năng lây truyền mầm bệnh, đồng thời dữ 5 x 103, 104 CFU/mL trong vòng 1 giờ (1 mL liệu phân tích mô đích bị xâm nhiễm bởi tác của vi khuẩn ở mỗi nồng độ 2,5 x 106, 5 x 106, nhân gây bệnh giúp tăng cường khả năng chẩn 107 CFU/mL pha loãng trong 1 lít nước), sau đó đoán phát hiện mầm bệnh ở vật chủ. nâng mức nước lên 5 lít cho mỗi bể. Ở nghiệm II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP thức tiêm, mỗi cá được tiêm vào nồng độ 2,5 x NGHIÊN CỨU 105, 5 x 105, 106 CFU/cá. Vi khuẩn cũng được sử 2.1. Vật liệu nghiên cứu dụng trộn vào thức ăn trong nghiệm thức cho ăn, 2.1.1. Cá thí nghiệm trong đó 3 mL dung dịch vi khuẩn 2,5 x 106, 5 x Cá tra khoảng 40 ngày tuổi, trọng lượng 106, 107 CFU/mL được trộn với thức ăn và chia trung bình 0,8 - 1g, được sử dụng cho thí đều thành 3 phần tương đương nhau cho 3 bể nghiệm cảm nhiễm. Sử dụng cá biểu hiện bên của mỗi nghiệm thức (mục đích để cá của mỗi TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 63
4. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II bể được cho ăn với 1 mL vi khuẩn trộn trong cho tiếp xúc và tiếp tục theo dõi. thức ăn, tương đương với lượng vi khuẩn đưa Trong thời gian cảm nhiễm không cho ăn vào mỗi bể trong nghiệm thức ngâm). Ở nghiệm đối với các lô ngâm và tiêm. Theo dõi và ghi thức cho cá bệnh tiếp xúc cá khỏe, chọn những nhận cá có biểu hiện của bệnh trắng đuôi, thối con cá lờ đờ, có biểu hiện bệnh trắng đuôi, thối đuôi, và cá chết trong vòng 1 tuần. Một số cá đuôi cho vào bể cá khỏe với tỷ lệ 10%, 20%, lờ đờ hoặc vừa mới chết được lấy mẫu để kiểm 30% tổng số cá thí nghiệm trong bể. Những con tra vi khuẩn F. columnare. Nồng độ và tỷ lệ gây cá bệnh (đã chết) được vớt ra khỏi bể sau 24 giờ nhiễm được thể hiện ở Bảng 1. Bảng 1: Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm. Đường truyền Ngâm (CFU/mL) Tiêm (CFU/cá) Tiếp xúc cá Cho ăn (CFU/ lây bệnh: khỏe bể thí nghiệm) 104 106 3:7 (30%) 107 Nồng độ cảm 5 x 103 5 x 105 2:8 (20%) 5 x 106 nhiễm 2,5 x 103 2,5 x 105 1:9 (10%) 2,5 x 106 2.3. Phân tích mô bệnh học của cá bệnh định danh F. columnare. Một hỗn hợp 25 μL trắng đuôi thối đuôi dung dịch cho phản ứng PCR chứa 1X green Cá bệnh (tự nhiên và sau cảm nhiễm) có Gotag reaction buffer, bao gồm 1,5 mM MgCl2, những biểu hiện trắng đuôi hoặc thối đuôi được 10 nmole cho mỗi 200 μM dNTPs, 10 pmole thu nguyên con và cố định trong dung dịch cho mỗi mồi, Taq DNA polymerase và 100 ng formol 10%. Mẫu mô (đuôi, mang, thận) được DNA mẫu. đúc parafin để cắt lát, sau đó xử lý loại parafin Chu trình PCR gồm có giai đoạn khởi đầu: bằng cồn và tiến hành nhuộm Wright – Giemsa, 94ºC trong 2 phút (1 chu kỳ); nhân bản PCR (30 Hematoxylin và Eosin (H&E) hoặc nhuộm chu kỳ) gồm có bước biến tính: 94ºC trong 30 Gram. giây – bước gắn mồi: 54 ºC trong 1 phút – bước Quan sát sự hiện diện của vi khuẩn trong kéo dài: 72ºC trong 1 phút; và giai đoạn kết thúc các mô dưới kính hiển vi quang học. kéo dài 72ºC trong 5 phút (1 chu kỳ). Dung dịch 2.4. Phương pháp kiểm tra mô đích của sau PCR được điện di trên gel agarose 1,5%, cá bệnh tự nhiên và sau cảm nhiễm cho sản phẩm có kích thước 675 bp (Darwish Cá bệnh (tự nhiên và sau cảm nhiễm) được và ctv., 2004). thu nguyên con và cố định bằng cồn 90% để 3. Phân tích thống kê kiểm tra bằng phương pháp PCR. Mẫu mô Kết quả được phân tích thống kê sử dụng (đuôi, mang, gan, thận) được tách bằng panh và phần mềm SPSS 13.0 for Windows, phân tích kéo đốt khử trùng sau mỗi lần tách mô. ANOVA 2 yếu tố sự khác biệt có ý nghĩa với độ DNA được tinh sạch bằng Wizard genomic tin cậy 95% (giá trị p<0,05). DNA purification kit (Promega, USA) theo hướng III. KẾT QUẢ dẫn của nhà sản xuất. Đoạn gene đặc hiệu loài 3.1. Cảm nhiễm xác định đường truyền được khuyếch đại bằng máy PCR (Biorad, USA) lây trong hỗn hợp GoTag (Promega, USA) sử dụng Ở phương pháp ngâm, cá bắt đầu chết từ hai mồi ColF 5’CAGTGGTGAAATCTGGT3’ giờ thứ 10 sau khi gây nhiễm. Cơ thể cá tiết nhớt và ColR 5’GCTCCTACTTGCGTAGT3’ để trầm trọng, nhớt bám vào mang và lớp da bên 64 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
5. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II ngoài, cá có biểu hiện mất thăng bằng (chúi đầu 1). Hơn nữa, ở những nghiệm thức cảm nhiễm xuống đáy bể). Cảm nhiễm với nồng độ cao, cá nồng độ vi khuẩn cao, mang và da cá tiết nhiều chết nhanh trong vòng 24 giờ. Ở phương pháp nhớt, cá có biểu hiện suy giảm hô hấp. tiêm, cá chết chậm hơn bắt đầu từ ngày thứ 2 Đối với lô cá cảm nhiễm bằng phương pháp sau cảm nhiễm và rải rác cho đến ngày thứ 5. ngâm, cá chết tỷ lệ cao từ 86,6% đến 100% Phương pháp cho tiếp xúc cá bệnh và cá khỏe, khi cảm nhiễm nồng độ vi khuẩn 2,5 x 103 – cá chết chậm hơn hai phương pháp ngâm và 104 CFU/mL. Ở phương pháp tiêm, cá chết từ tiêm. Tuy nhiên ở phương pháp cho ăn, không 56,6% đến 100% với nồng độ tiêm 2,5 x 105 ghi nhận có cá chết. Biểu hiện bên ngoài của cá – 106 CFU/cá. Khi cho tiếp xúc giữa cá bệnh và bệnh cho thấy một số con bị cụt vây đuôi hoặc cá khỏe, tỷ lệ cá chết từ trung bình từ 11% đến có lớp nhầy trắng đục bám bên ngoài, tương tự 43%, cao nhất ở tỷ lệ tiếp xúc cá bệnh với 30% như biểu hiện ở những cá bệnh tự nhiên (Hình (Bảng 2). Bảng 2: Tỷ lệ cá chết ở các phương pháp gây nhiễm khác nhau. Phương pháp Nồng độ Tổng số cá chết/ Tỉ lệ cá chết (%) cá cảm nhiễm Ngâm (CFU/mL) 104 60/60 100 5 x 103 60/60 100 2,5 x 103 52/60 86,6 Tiêm (CFU/cá) 106 60/60 100 5 x 105 60/60 100 2,5 x 105 34/60 56,6 Tiếp xúc cá bệnh và cá khỏe 30% 18/42 43 (tỷ lệ) 20% 18/48 37,5 10% 6/54 11 Cho ăn (CFU/bể thí nghiệm) 107 0/60 0 5 x 106 0/60 0 2,5 x 106 0/60 0 Hình 1A: Cá bị bệnh trắng đuôi, thối đuôi tự nhiên. Cá bị hoại tử và ăn mòn nửa thân dưới, gây cụt đuôi (1A, 1B). Lớp da bên ngoài ở vùng đuôi tiết nhiều nhớt, mất màu. Một số vùng có màu vàng nhạt do vi khuẩn bám vào (Hình 1B, mũi tên). TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 65
6. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Cá bị bệnh trắng đuôi, thối đuôi sau cảm nhiễm. Đuôi bị ăn mòn, hoại tử, lớp da bên ngoài tiết nhiều nhớt, da mất màu (Hình 1C). Cơ đuôi bị hoại tử, ăn mòn đến xương (Hình 1D). Hình 1: Biểu hiện bệnh tích của cá bị bệnh trắng đuôi, thối đuôi. 3.2. Phân tích mô bệnh học của cá bệnh biểu mô, đặc biệt ở phần đuôi bị hoại tử và vùng trắng đuôi, thối đuôi nhớt trắng đục bên ngoài, một số vùng biểu bì Phân tích mô bệnh học lát cắt mang và gốc bên ngoài bị bong tróc ra khỏi lớp mô bên trong đuôi cho thấy có sự hiện diện của vi khuẩn hình (Hình 2). Tuy nhiên, không thấy có sự thay đổi sợi ở mang, lá mang bị hoại tử, cấu trúc tế bào cấu trúc hoặc tổn thương ở các cơ quan nội quan mang bị phá vỡ, có chỗ kết dính. Ở lát cắt cơ (thận, gan). đuôi, nhiều vi khuẩn dạng hình sợi bám ở vùng Cá bệnh tự nhiên, lát cắt mang (nhuộm H&E, x Cá bệnh tự nhiên, lát cắt đuôi (nhuộm Wright – 1500). Vi khuẩn quan sát thấy rải rác ở lá mang Giemsa, x 1500). Vi khuẩn quan sát thấy nhiều ở (mũi tên), mang bị hoại tử. lớp da bị tuột nhớt (mũi tên liền), lớp biểu bì bị long tróc khỏi phần cơ (mũi tên đứt khúc). Cá cảm nhiễm (nhuộm Wright – Giemsa), x1500. Vi khuẩn quan sát thấy nhiều ở vùng da và vùng cơ đuôi bị hoại tử (mũi tên 2C, 2D). 66 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
7. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Cá cảm nhiễm (nhuộm Gram). Vi khuẩn quan sát thấy nhiều ở vùng da và vùng cơ đuôi bị hoại tử (mũi tên 2E, x40). Nhiều vi khuẩn mảnh, dài, Gram âm ở vị trí N (Hình 2F, x1500). Mô thận (2G) và mô gan (2H) từ cá bệnh. Cấu trúc mô bình thường, không quan sát thấy vi khuẩn có hình dạng dài, mảnh. Hình 2: Phân tích mô bệnh học cá bệnh trắng đuôi, thối đuôi. 3.3. Sự hiện diện của F. columnare trên đó là gốc đuôi và thận. Ở cá bệnh tự nhiên, tỷ các mô ở cá bệnh tự nhiên và cá cảm nhiễm lệ nhiễm ở gốc đuôi và mang có tỷ lệ cao (90 Phân tích sự hiện diện của vi khuẩn F. - 100%), ở thận nhiễm thấp hơn (50%). Tuy columnare trên các mô lấy từ cá bệnh (tự nhiên nhiên, tương tự ở cá cảm nhiễm, vi khuẩn F. và cảm nhiễm) bằng kỹ thuật PCR cho thấy ở columnare cũng không được tìm thấy ở mô gan mang có sự hiện diện nhiều vi khuẩn nhất, sau (Bảng 3). Bảng 3: Tỷ lệ nhiễm của F. columnare trên các mô ở cá bệnh. Mô (tỷ lệ nhiễm/số mẫu cá; tỷ lệ nhiễm %) Gốc đuôi Mang Thận Gan Cá bệnh sau cảm nhiễm 6/10 (60%) 7/10 (70%) 5/10 (50%) 0/10 (0%) (phương pháp ngâm) Cá bệnh sau cảm nhiễm 2/10 (20%) 6/10 (60%) 2/10 (20%) 0/10 (0%) (phương pháp tiêm) Cá bệnh tự nhiên 10/10 (100%) 9/10 (90%) 5/10 (50%) 0/10 (0%) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 67
8. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 3: Hiện diện của F. columnare trên các mô ở cá bệnh. Mức độ nhiễm trên các mô cho thấy cơ nhân gây bệnh, còn cơ quan nội quan (thận) bị đuôi và mang là những mô đích quan trọng xâm nhiễm sau. (Hình 3, Hình 4) bị tác động đầu tiên bởi tác Hình 4. Kết quả điện di sản phẩm PCR của các mẫu mô cá bệnh tự nhiên. 1: Cơ đuôi (cá 1); 2: Mang (cá 1); 3: Gan (cá 1); 4: Thận (cá 1); 5: Cơ đuôi (cá 2); 6: Mang (cá 2); 7: Gan (cá 2); 8: Thận (cá 2); 9: Cơ đuôi (cá 3); 10: Mang (cá 3); 11: Gan (cá 3); 12: Thận (cá 3); 13: Cơ đuôi (cá 4); 14: Mang (cá 4); 15: Gan (cá 4); 16: Thận (cá 4); 17: Cơ đuôi (cá 5); 18: Mang (cá 5); 19: Gan (cá 5); 20: Thận (cá 5); 21: Chứng dương F. columnare CF1-Thai; 22: chứng âm; 23: 100 bp ladder. Kết quả phân tích ANOVA 2 yếu tố đánh diện của F. columnare lên các mô được khảo sát giá trên phương pháp gây nhiễm và mô đích tác (p<0,05). Có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm của vi động cho thấy có sự khác biệt trong ảnh hưởng khuẩn lên các mô (p<0,05) giữa phương pháp tương tác của phương pháp gây nhiễm và sự hiện tiêm với cá bệnh tự nhiên, tuy nhiên tỷ lệ này 68 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
9. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II không có sự khác biệt giữa phương pháp ngâm mang cũng không bị nhiều tổn thương như ở và cá bệnh tự nhiên. gốc đuôi. Ngược lại, theo một số nghiên cứu So sánh tỷ lệ nhiễm F. columnare ở các về bệnh columnaris ở các loài cá có vảy, F. mô khảo sát cho thấy giữa cơ đuôi và mang, cơ columnare được quan sát thấy nhiều ở mô mang đuôi và thận là tương đương nhau. Tuy nhiên, và lớp da bên ngoài, mang thường là cơ quan có sự khác biệt có ý nghĩa giữa mang và thận, bị tổn thương nhiều nhất. Sự khác biệt này có giữa gan và các mô khác (cơ đuôi, mang, thận) thể giải thích do lớp da mềm ở cá da trơn làm (p<0,05). cho vi khuẩn dễ xâm nhập và gây bệnh nhanh IV. THẢO LUẬN hơn, còn ở cá có vảy nhờ lớp vảy cứng bảo vệ Các nghiên cứu về bệnh do vi khuẩn F. phần da bên ngoài nên mang trở nên dễ bị thâm columnare thường sử dụng phương pháp tiêm nhập hơn. Kết quả cảm nhiễm cho thấy phương hoặc ngâm, trong đó đa số là phương pháp ngâm pháp ngâm có tỷ lệ cá chết cao nhất so với các với liều gây chết 100% từ 104 CFU/mL đến 107 phương pháp còn lại, kết hợp với quan sát vi thể CFU/mL ở cá nheo Mỹ (Declercq và ctv., 2015), lát cắt mô chứng tỏ vi khuẩn từ môi trường nuôi cá rô (Dong và ctv., 2016). Trong nghiên cứu tác động vào cơ thể cá thông qua việc xâm nhập này chúng tôi bổ sung thêm phương pháp cho và gây tổn thương cho các mô bên ngoài. Cá tiếp xúc giữa cá bệnh và cá khỏe và phương chết do bị mất thăng bằng và suy giảm hô hấp. pháp cho ăn. So với các nghiên cứu khác, liều Đồng thời, vi khuẩn bám vào da kích thích hệ gây chết 100% của các chủng chúng tôi sử dụng thống miễn dịch tiết nhiều chất nhầy có tác dụng tương đối thấp (5 x 103 CFU/mL ở liều ngâm, 5 bao lấy vi khuẩn để bảo vệ cơ thể, tạo thành lớp x 106 CFU/cá ở liều tiêm), có thể do cá sử dụng nhớt bao quanh bên ngoài da, đặc biệt thấy rõ ở cho thí nghiệm cảm nhiễm có kích cỡ nhỏ hơn vùng đuôi. F. columnare có thể tiếp cận và bám nên dễ mẫn cảm với tác nhân gây bệnh. Phương vào lớp bên trong của tế bào bằng cách sản sinh pháp cho ăn không quan sát thấy cá chết, có khả ra biofilm trên bề mặt trong vòng 6 giờ và tạo năng do đường truyền lây không thích hợp hoặc thành quần thể biofilm trong vòng 24 giờ (Cai lượng vi khuẩn đưa vào chưa đủ hoặc khả năng và ctv., 2013). Một số kết quả nghiên cứu cho vi khuẩn bị giảm độc lực trong quá trình trộn thấy vi khuẩn tạo thành màng biofilm trên bề vào thức ăn. mặt mang, ức chế sự hấp thu oxy của mang, dẫn Ở cá da trơn, da là bộ phận quan trọng để vi đến tỷ lệ tử vong cao ở cá chép và cá hồi vân khuẩn tấn công. Cơ thể cá tiết ra lớp chất nhầy (Declercq và ctv., 2015). để bảo vệ vật chủ khỏi sự xâm nhiễm của tác Các nghiên cứu về mô đích tác động của F. nhân bên ngoài, dẫn đến hiện tượng tuột nhớt, columnare trên cá nước ngọt cho thấy vi khuẩn làm mất màu phần da ở thân dưới hay còn gọi chủ yếu được tìm thấy ở mang và cơ (Bullard là bệnh trắng đuôi. Vi khuẩn được tìm thấy và ctv., 2011) (Declercq và ctv., 2015), ngoài ra nhiều ở phần gốc đuôi, nhờ cơ chế tiết enzyme vi khuẩn còn được tìm thấy ở thận và lách bằng Chondroitin lyase phân giải protein làm cho kỹ thuật PCR (Patra và ctv., 2016), hoặc các cơ cơ bị phân hủy, dẫn đến hiện tượng cá bị mòn quan nội tạng như gan, thận, lách nhưng ở mức đuôi, lở loét phần thân dưới. Ngoài ra, vi khuẩn độ nhẹ bằng kỹ thuật lai in situ DNA (Dong và còn được quan sát thấy nhiều ở mang bằng ctv., 2015). Nghiên cứu của Suebsing và ctv. kỹ thuật phết lam và nuôi cấy trên thạch, tuy 2015 bằng kỹ thuật LAMP- casein trên cá rô nhiên phân tích mô bệnh học trên mang cá tra phi cho thấy F. columnare hiện diện trong nước bệnh phát hiện ít vi khuẩn. Hơn nữa, phần mô nuôi, tiếp xúc với cá thông qua mang, sau đó đi TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 69
10. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II vào hệ tuần hoàn và từ đó xâm nhiễm vào cơ trung nhiều ở vùng gốc đuôi. Kiểm tra sự hiện quan sinh sản, trứng phôi, và cá bột (Suebsing diện của vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR trên các và ctv., 2015). mô cơ (gốc đuôi), mang, gan, thận cho thấy vi Việc phân tích sự hiện diện của vi khuẩn khuẩn có nhiều ở mô cơ và mang, ở thận ít hơn trên các mô của cá tra bệnh bằng kỹ thuật PCR và không thấy có sự hiện diện ở gan. Mức độ cho thấy mang và gốc đuôi có tỷ lệ nhiễm cao. nhiễm trên các mô cho thấy cơ đuôi và mang là Đối với cơ quan nội tạng, thận có bị nhiễm F. những mô đích quan trọng bị tác động đầu tiên columnare nhưng tỷ lệ thấp hơn và sản phẩm bởi tác nhân gây bệnh, chứng tỏ cơ chế tác động khuyếch đại từ PCR cũng ít hơn so với mang của vi khuẩn lên cá là xâm nhiễm và tấn công và cơ, có khả năng mô thận bị nhiễm sau do từ các cơ quan bên ngoài, còn cơ quan nội quan cơ chế tác động của vi khuẩn từ bên ngoài (thận) bị xâm nhiễm sau. vào hoặc lượng mô sử dụng để phân tích mẫu LỜI CÁM ƠN: Nghiên cứu này được thực không tương đương nhau (do cỡ cá nhỏ). Mô hiện thuộc nội dung đề tài: “Nghiên cứu bệnh gan không cho thấy có hiện diện của vi khuẩn trắng đuôi, thối đuôi trên cá tra giống và giải này, chứng tỏ gan không phải là mô đích quan pháp phòng trị” với nguồn kinh phí được cấp từ trọng của F. columnare. Như vậy vi khuẩn F. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn. Chúng columnare tác động mạnh nhất vào các cơ quan tôi cũng chân thành cảm ơn TS. Đồng Thanh bên ngoài, phân hủy protein gây hoại tử mô (cơ Hà (Centex Shrimp – Trường đại học Mahidol, và mang). Đối với cá da trơn, vùng gốc đuôi đặc Thái Lan) đã cung cấp chủng đối chứng dương biệt bị tổn thương, dẫn đến hiện tượng mất màu Flavobacterium columnare. da ở nửa thân dưới và vùng đuôi (hay còn gọi là TÀI LIỆU THAM KHẢO trắng đuôi) ở trường hợp chết cấp tính. Trường Austin, B., & Austin, D. A., 1999. Bacterial Fish hợp bệnh tiến triển chậm hơn, phần đuôi của cá Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish (Vol. XXVIII). bị ăn mòn hoặc gốc đuôi bị đứt gãy, nửa thân Barony, G. M., Tavares, G. C., Assis, G. B., Luz, R. dưới bị lở loét. K., Figueiredo, H. C., & Leal, C. A., 2015. New V. KẾT LUẬN hosts and genetic diversity of Flavobacterium Phương pháp cảm nhiễm bằng cách ngâm columnare isolated from Brazilian native species cá trong dịch vi khuẩn cho kết quả cao nhất and Nile tilapia. Dis Aquat Organ, 117(1), 1-11. (từ 86,6 - 100% ở nồng độ cảm nhiễm từ 2,5 doi: 10.3354/dao02931. Bullard, S., McElwain, A., & Arias, C., 2011. x 103 - 104 CFU/mL) so với phương pháp tiêm Scanning Electron Microscopy of “Saddleback” và phương pháp cho tiếp xúc cá bệnh - cá khỏe. Lesions Associated with Experimental Infections Hơn nữa, cá trong các nghiệm thức ngâm chết of Flavobacterium columnare in Channel Catfish, nhanh hơn so với các nghiệm thức khác, cho Ictalurus punctatus (Siluriformes: Ictaluridae), thấy con đường xâm nhập từ bên ngoài vào tác and Zebrafish, Danio rerio (Cypriniformes: động đến cá nhiều hơn thâm nhập từ bên trong Cyprinidae). Journal of the World cơ thể. Aquaculture Society, 42. doi: 10.1111/j.1749- 7345.2011.00527.x Có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm của vi Bullard, S. A., Mohammed, H., & Arias, C. R., 2013. khuẩn lên các mô giữa phương pháp tiêm với First record of the fish pathogen Flavobacterium cá bệnh tự nhiên, tuy nhiên tỷ lệ này không có columnare genomovar II from bluegill, Lepomis sự khác biệt giữa phương pháp ngâm và cá bệnh macrochirus (Rafinesque), with observations on tự nhiên. Phân tích mô bệnh học cho thấy vi associated lesions. J Fish Dis, 36(4), 447-451. khuẩn chủ yếu bám ở lớp biểu bì ngoài da, tập doi: 10.1111/jfd.12005 70 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
11. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Cai, W., De La Fuente, L., & Arias, C. R., 2013. Dong, H., Nguyen, V., Phiwsaiya, K., Gangnonngiw, Biofilm formation by the fish pathogen W., Withyachumnarnkul, B., Rodkhum, C., & Flavobacterium columnare: development and Senapin, S., 2015. Concurrent infections of parameters affecting surface attachment. Applied Flavobacterium columnare and Edwardsiella and environmental microbiology, 79(18), 5633- ictaluri in striped catfish, Pangasianodon 5642. doi: 10.1128/AEM.01192-13 hypophthalmus in Thailand. Aquaculture, 448. Cunningham, F. L., Jack, S. W., Hardin, D., & Wills, R. doi: 10.1016/j.aquaculture.2015.05.046 W., 2012. Pond-level risk factors associated with Dong, H., Senapin, S., LaFrentz, B., & Rodkhum, C., columnaris disease on Mississippi commercial 2016. Virulence assay of rhizoid and non-rhizoid catfish farms. J Aquat Anim Health, 24(3), 178- morphotypes of Flavobacterium columnare in 184. doi: 10.1080/08997659.2012.675932 red tilapia, Oreochromis sp., fry (Vol. 39). Dalsgaard, I., 1993. Virulence mechanisms in Hawke, J. P., & Thune, R. L., 1992. Systemic Cytophaga psychrophila and other Cytophaga- Isolation and Antimicrobial Susceptibility of like bacteria pathogenic for fish. Annual Review Cytophaga columnaris from Commercially of Fish Diseases, 3, 127-144. doi: Reared Channel Catfish. Journal of org/10.1016/0959-8030(93)90032-7 Aquatic Animal Health, 4(2), 109-113. doi: Darwish, A. M., Ismaiel, A. A., Newton, J. C., & 10.1577/1548-8667(1992)004 Tang, J., 2004. Identification of Flavobacterium 2.3.CO;2 columnare by a species-specific polymerase Morrison, C., Cornick, J., Shum, G., & Zwicker, chain reaction and renaming of ATCC43622 B., 1981. Microbiology and histopathology of strain to Flavobacterium johnsoniae. Molecular ‘saddleback’ disease of underyearling Atlantic and Cellular Probes, 18(6), 421-427. doi: https:// salmon, Salmo salar L (Vol. 4). doi.org/10.1016/j.mcp.2004.07.002 Patra, A., Sarker, S., Banerjee, S., Adikesavalu, Declercq, A. M., Chiers, K., Haesebrouck, F., Van H., Debadyuti, & Abraham, T. J., 2016. Rapid den Broeck, W., Dewulf, J., Cornelissen, M., & Detection of Flavobacterium columnare Decostere, A., 2015. Gill infection model for Infection in Fish by Species-specific Polymerase columnaris disease in common carp and rainbow Chain Reaction. Journal of Aquaculture trout. J Aquat Anim Health, 27(1), 1-11. doi: Research & Development, 7. doi: 10.4172/2155- 10.1080/08997659.2014.953265 9546.1000445. Decostere, A., 2002. Flavobacterium columnare Pilarski, F., Rossini, A., & Ceccarelli, P., 2008. infections in fish: the agent and its adhesion to Isolation and characterization of Flavobacterium the gill tissue. Verh K Acad Geneeskd Belg, columnare (Bernardet et al., 2002) from four 64(6), 421-430. tropical fish species in Brazil. Brazilian Journal Decostere, A., Ducatelle, R., & Haesebrouck, F., of Biology, 68, 409-414. 2002. Flavobacterium columnare (Flexibacter Scott, S. J., & Bollinger, T. K., 2014. Flavobacterium columnaris) associated with severe gill necrosis columnare: an important contributing in koi carp (Cyprinus carpio L). Vet Rec, 150(22), factor to fish die-offs in southern lakes of 694-695. Saskatchewan, Canada. Journal of Veterinary Decostere, A., Haesebrouck, F., Charlier, G., Diagnostic Investigation, 26(6), 832-836. doi: & Ducatelle, R., 1999. The association of 10.1177/1040638714553591 Flavobacterium columnare strains of high and low Shoemaker, C. A., Klesius, P. H., Drennan, J. D., virulence with gill tissue of black mollies (Poecilia & Evans, J. J., 2011. Efficacy of a modified sphenops). Vet Microbiol, 67(4), 287-298. live Flavobacterium columnare vaccine in fish. Decostere, A., Haesebrouck, F., & Devriese, L. A., Fish Shellfish Immunol, 30(1), 304-308. doi: 1998. Characterization of four Flavobacterium 10.1016/j.fsi.2010.11.001 columnare (Flexibacter columnaris) strains Soto, E., Mauel, M., Karsi, A., & Lawrence, M. L., isolated from tropical fish. Vet Microbiol, 62(1), 2008. Genetic and virulence characterization of 35-45. Flavobacterium columnare from channel catfish TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 71
12. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II (Ictalurus punctatus) (Vol. 104). skin and gills. Dis Aquat Organ, 63(1), 61-68. Suebsing, R., Kampeera, J., Sirithammajak, doi: 10.3354/dao063061 S., Withyachumnarnkul, B., Turner, W., & Tien, N. T., Dung, T. T., Tuan, N. A., & Crumlish, Kiatpathomchai, W., 2015. Colorimetric M., 2012. First identification of Flavobacterium Method of Loop-Mediated Isothermal columnare infection in farmed freshwater Amplification with the Pre-Addition of Calcein striped catfish Pangasianodon hypophthalmus. for Detecting Flavobacterium columnare and Dis Aquat Organ, 100(1), 83-88. doi: 10.3354/ its Assessment in Tilapia Farms. Journal of dao02478 Aquatic Animal Health, 27(1), 38-44. doi: Tripathi, N. K., Latimer, K. S., Gregory, C. R., Ritchie, 10.1080/08997659.2014.966212 B. W., Wooley, R. E., & Walker, R. L., 2005. Suomalainen, L. R., Tiirola, M. A., & Valtonen, Development and evaluation of an experimental E. T., 2005. Effect of Pseudomonas sp. MT5 model of cutaneous columnaris disease in koi baths on Flavobacterium columnare infection of Cyprinus carpio. J Vet Diagn Invest, 17(1), 45- rainbow trout and on microbial diversity on fish 54. doi: 10.1177/104063870501700109 72 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
13. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II INFECTED TRANSMISSIONS AND TARGET TISSUES ATTACKED BY Flavobacterium columnare ON TRA CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) Nguyen Ngoc Du1*, Nguyen Thi Tuyet Mai2, Ma Tu Lan1, Le Thi Bich Thuy3, Doan Van Cuong1 ABSTRACT The study was to determine the infected transmissions of the bacteria Flavobacterium columnare causing white and tail rot disease in striped catfish fingerling. Bath immersion challenge presented the highest mortality rate (86,6 – 100%) with 2,5 x 103 to 104 CFU/mL of bacteria. Injected challenge had 56,6 to 100% of mortality at the bacterial concentration from 2,5 x 105 to 106 CFU/fish. The diseased – heathy contact challenge at the rate of 10%, 20%, 30% of total experimental fish resulted mortality from 11 to 45%. However, there was no dead fish in oral challenge experiments. Histopathological examinations of lethally infected fish revealed that the bacteria were adhered the most in the mucous of caudal tail and necrosis tissues. The PCR analysis of tissues taken from diseased fish has detectedF. columnare most in tail and gill. The bacteria was also found in kidney but not as frequency as in the other tissues, yet never been identified in liver. The bacteria infected tissues were the same in immersed infection group and naturally infected group, but significantly different beetween injected infection and naturally diseased fish (p<0.05). Keywords: Flavobacterium columnare, striped catfish, infected transmission, target tissues. Người phản biện: TS. Trân Thi Tuyêt Hoa Người phản biện: TS. Ly Thi Thanh Loan Ngày nhận bài: 10/10/2020 Ngày nhận bài: 10/10/2020 Ngày thông qua phản biện: 31/10/2020 Ngày thông qua phản biện: 10/11/2020 Ngày duyệt đăng: 05/12/2020 Ngày duyệt đăng: 05/12/2020 1 Research Institute for Aquaculture No.2 2 International University, HCMC 3 HCM Agricultural technical college * Email: ngocduaqua@yahoo.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 73