Một số phương pháp phân tích sắc ký

72 trang Gia Huy 25/05/2022 1590

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Một số phương pháp phân tích sắc ký", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

mot_so_phuong_phap_phan_tich_sac_ky.ppt

Nội dung text: Một số phương pháp phân tích sắc ký

GIỚI THIỆU MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ
CHƯƠNG 20 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ 20.1 Sắc ký hấp phụ lỏng (trên cột) 20.2 Sắc ký phân bố (trên cột) 20.3 Sắc ký trao đổi ion 20.4 Sắc ký rây phân tử 20.5 Sắc ký bản mỏng 20.6 Sắc ký giấy 20.7 Sắc ký khí 20.8 Sắc ký lỏng hiệu năng cao 20.9 Ứng dụng
CHƯƠNG 20 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ 20.1 SẮC KÝ HẤP PHỤ LỎNG (TRÊN CỘT) – Nguyên tắc – Hệ sắc ký lỏng – Kỹ thuật thực nghiệm & ứng dụng
NGUYÊN TẮC Sắc ký hấp phụ lỏng: Là quá trình tách do ái lực khác nhau của các cấu tử lỏng đối với chất hấp phụ rắn, bao gồm: Lực Van der Waals Lực cảm ứng Lực liên kết hĩa học Lực liên kết hydro Đa số đường đẳng nhiệt tuân theo PT Langmuir (DD lỗng: PT Henry)
HỆ SẮC KÝ HẤP PHỤ LỎNG Yêu cầu đối với chất hấp phụ Khơng tương tác hố học với cấu tử, khơng PHA cĩ hoạt tính xúc tác để tránh các P/Ứ phụ TĨNH Chọn lọc cao (Chất Hấp Ổn định để các kết quả cĩ độ lặp lại cao Phụ) Diện tích bề mặt riêng và kích thước hạt thích hợp
HỆ SẮC KÝ HẤP PHỤ LỎNG Các chất hấp phụ phổ biến Phân cực và cĩ tính lưỡng tính Nhơm Hoạt tính phụ thuộc rất lớn PHA oxide vào hình dạng và độ ẩm. TĨNH Dùng trong sắc ký dạng γ (Chất Hấp Hấp phụ tốt sản phẩm dầu mỏ, Phụ) Silicagel acid béo và ester của chúng, SiO2.xH2O các amin thơm và các hợp chất hữu cơ khác
HỆ SẮC KÝ HẤP PHỤ LỎNG Các chất hấp phụ phổ biến Bề mặt riêng 1300–1700 m2/ g, được điều chế từ gỗ, lignin, Than xương, than đá, than nâu PHA Hoạt Hấp phụ rất tốt nhưng kém ổn TĨNH Tính định và màu quá đen. (Chất Thường dùng tách các chất cao Hấp phân tử hoặc chất thơm ra khỏi Phụ) các chất cĩ phân tử lượng thấp Cịn cĩ thể dùng MgO, MgCO3, CaCO3, bột talc và các chất hấp phụ biến tính, ví dụ như Silicagel tẩm bạc nitrate dùng tách các olefin ra khỏi parafin
HỆ SẮC KÝ HẤP PHỤ LỎNG Yêu cầu đối với pha động - độ tinh khiết cao - hịa tan tương đối tốt tất cả các cấu tử PT - bị hấp phụ tối thiểu trên pha tĩnh - khơng phản ứng hố học với chất tan và chất hấp phụ PHA Để tăng khả năng tách, rửa giải bằng nhiều ĐỘNG dung mơi theo thứ tự khả năng giải hấp tăng dần. Dung mơi cĩ hằng số điện mơi càng lớn cĩ khả năng giải hấp càng cao khi chất hấp phụ càng phân cực Thường dùng kỹ thuật chân khơng hay áp suất cao để bơm pha động qua cột (SK lỏng cao áp)
HỆ SẮC KÝ HẤP PHỤ LỎNG Dãy elutrop của Trappe STT Dung mơi ε ST Dung mơi ε T 01 Nước 81,0 11 Dioxane - 02 Acid acetic 31,2 12 Chloroform 5,2 03 Ethylene Glycol - 13 Benzene 2,3 04 Rượu metylic 31,2 14 Toluen 2,3 PHA 05 Rượu etylic 25,8 15 TrichlorEthylene 3,4 ĐỘNG 06 Rượu n- 22,8 16 CCl4 2,2 propylic 07 Acetone 21,5 17 CS2 - 08 DichlorEthane 10,4 18 Cyclohexane 2,0 09 Ethyl Acetate 6,1 19 n - Pentane - 10 Ether Etylic 4,4 20 Ether dầu hỏa 1,9
KT THỰC NGHIỆM & ỨNG DỤNG Cột SK bằng thủy tinh, thép, nhơm, đồng, CỘT chất dẻo, kim loại , cĩ dạng hình trụ hoặc SẮC hình nĩn. Chiều dài cột L từ vài cm tới 10- KÝ 20m; đườngkính cột d từ vài mm tới 10–20cm HẤP L PHỤ Theo kinh nghiệm: = 40 −100 d VÀ KT Quá trình tách cĩ thể được thực hiện theo TÁCH PP đi xuống hoặc đi lên Tăng vận tốc của dung mơi bằng kỹ thuật chân khơng hoặc kỹ thuật cao áp
KT THỰC NGHIỆM & ỨNG DỤNG CỘT SẮC KÝ HẤP PHỤ VÀ (a) KT (b) TÁCH Các loại cột sắc ký hấp phụ: cột sắc ký đi xuống (a); cột sắc ký đi lên (b); cột làm việc ở chân khơng(c) (c)
CHƯƠNG 20 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ 20.2 SẮC KÝ PHÂN BỐ (TRÊN CỘT) – Nguyên tắc – Hệ sắc ký phân bố trên cột – Kỹ thuật thực nghiệm & ứng dụng
NGUYÊN TẮC Dựa trên sự phân bố khơng giống nhau của chất tan giữa φS lỏng và φm lỏng khơng trộn lẫn vào nhau. φS lỏng được hấp phụ trên bề mặt chất rắn mang hoặc liên kết hố học với chất mang Đường đẳng nhiệt phân bố thường tuyến tính, nhưng cũng cĩ thể bị lõm hoặc lồi do sự phân ly hoặc sự liên hợp của các chất trong dung mơi Lý thuyết SK phân bố thường được xem là lý tưởng
HỆ SẮC KÝ PHÂN BỐ TRÊN CỘT Bao gồm chất mang, φS lỏng và φm lỏng (1) trộn φS và φmtrước khi cho cả hai đi qua mẫu Để bảo đảm tính ổn định của hệ: (2) cho φS liên kết hố học với chất mang (φS liên kết) Chất mang phải cĩ bề mặt riêng lớn, kích thước hạt nhỏ (1- 200µm), thường dùng diatomite, thủy tinh xốp, silicagel, nhơm oxide
HỆ SẮC KÝ PHÂN BỐ TRÊN CỘT Chất mang ưa nước được dùng khi φS là nước cịn φm là dung mơi hữu cơ VD chất mang là silicagel hoặc bột xenluloze dùng tách hỗn hợp các chất phân cực như acid amin, dẫn xuất của piridin ; φm là phenol bão hịa nước hoặc các dung mơi khác Chất mang kỵ nước được dùng khi φS là các chất lỏng khơng phân cực như eter dầu hỏa, dầu parafin cịn φm là dung mơi phân cực hoặc nước VD, để tách các acid béo cao phân tử , chất mang thường là bột cao su, φS là benzene, φm là hỗn hợp rượu etylic – nước Pha động cĩ độ nhớt càng thấp càng cĩ lợi về mặt động học, vì độ hiệu nghiệm của cột tăng lên
KT THỰC NGHIỆM & ỨNG DỤNG CÁCH Hịa tan φ vào dung mơi dễ bay hơi và cho CHUẨN S chất mang xốp vào DD thu được BỊ PHA Cho bay hơi dung mơi (đun nĩng hoặc hút TĨNH chân khơng) CỘT SẮC Tương tự cột dùng trong sắc ký hấp phụ KÝ trên cột
CHƯƠNG 20 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ 20.3 SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION – Nguyên tắc – Ionit – Cơ chế trao đổi ion
NGUYÊN TẮC Dựa trên hiện tượng trao đổi thuận nghịch giữa các ion linh động của φS rắn với các ion trong DD PT khi cho DD này đi qua cột được nạp đầy φS PP SK ion cho phép tách các ion và các phân tử phân cực dựa trên sự khác biệt về điện tích của các phân tử φS: chất trao đổi ion (ionit)
NGUYÊN TẮC
IONIT Ionit là các hợp chất polymer vơ cơ và hữu cơ khơng tan cĩ chứa các nhĩm hoạt động, gồm: Ionit vơ cơ tự nhiên Ionit vơ cơ tổng hợp (zeolite, đất sét, (alumosilicate như glauconit ) permutit, zeolite) Ionit hữu cơ tự nhiên Ionit hữu cơ tổng hợp (xenlulose, lơng thú, (nhựa trao đổi ion) than bùn, than nâu )
IONIT Là hợp chất polymer hữu cơ gồm một sườn hydrocarbon (polystyrene)mang các nhĩm chức hoạt động, nối với các ion linh động bằng lực hút tĩnh điện NHỰA TRAO Gồm cationit, anionit, ionit lưỡng tính ĐỔI (trao đổi anion lẫn cation); ionit cĩ chứa ION nhĩm tạo phức; ionit chứa nhĩm oxy hĩa khử; ionit lỏng và màng trao đổi ion Hiện nay, các loại nhựa trao đổi ion được sản xuất chủ yếu bằng PP ngưng tụ hoặc trùng hợp monome
IONIT Chứa nhĩm hoạt động R– , ion linh động là M+. Anion R– cĩ thể là sulphonate NHỰA (nhựa S), carboxylate (nhựa CM), nhĩm TRAO ĐỔI phosphate hoặc amino diacetate: ION: Cationit
IONIT Cĩ dạng R+X – với R+ thường là nhĩm amine nên anionit mang tính base NHỰA TRAO Anionit phổ biến: nhựa Q (amine bậc 4); ĐỔI nhựa DEAE ION: Anionit
IONIT Cĩ khả năng trao đổi cả cation lẫn NHỰA anion, cũng được tổng hợp bằng hai PP TRAO ngưng tụ và trùng hợp ĐỔI ION: Ví dụ để tổng hợp ionit lưỡng tính bằng IONIT PP trùng hợp, đầu tiên trùng hợp styren LƯỠNG hoặc chlorua vinyl với DVB rồi sau đĩ TÍNH tiếp tục amin hĩa và sulpho hĩa sản phẩm thu được
IONIT Cationit sulphonate (- SO3H) là cationit acid mạnh, anionit amine tứ là anionit kiềm mạnh (hoạt động tốt trong mọi mơi NHỰA TRAO trường acid, base, trung tính) ĐỔI ION: Cationit carboxylate (-COOH ) là cationit ĐẶC acid yếu (hoạt động tốt trong mơi ĐIỂM trường kiềm) Anionit amine tam, nhị, nhất là các anionit kiềm yếu (hoạt động tốt trong mơi trường acid)
CƠ CHẾ TRAO ĐỔI ION Mạng lưới của ionit là mạng khơng gian cao phân tử khơng đồng đều của các liên kết hydrocarbon Khi ngâm nhựa vào nước, nhựa trương nở, các nhĩm chứa ion trở nên linh động hơn và cĩ thể bị phân ly một phần Các phản ứng trao đổi xảy ra giữa các ion của pha tĩnh và các ion trong DD rất giống với các phản ứng trao đổi (P/Ư hố học) thơng thường Tính ưa nước của ionit được quyết định bởi cấu trúc của ionit Về mặt định lượng, khả năng trao đổi của ionit là trao đổi theo đương lượng các chất
CƠ CHẾ TRAO ĐỔI ION Cơ chế trao đổi ion của cationit Giả sử cationit được sử dụng là nhựa sulphonate R’SO H. Sau khi được ngâm DUNG 3 vào nước, nhựa bị trương, chuyển thành DỊCH R’SO - H+. Khi tiếp xúc với DD chứa ion CHỨA 3 Mn+ sẽ xảy ra phản ứng trao đổi như sau: MỘT CẤU nR’SO - H+ + Mn+ R’SO - Mn+ +nH+ TỬ 3 (R) (dd) 3 (R) (dd) Hoặc n H+(R) +Mn+(dd) Mn+(R) + nH+ (dd)
CƠ CHẾ TRAO ĐỔI ION Cơ chế trao đổi ion của anionit Amin của anionit tác dụng tương tự amin trong DD nước: DUNG + – DỊCH RNH2 + H2O RNH3 OH CHỨA MỘT Ion OH – trên anionit trao đổi với các anion CẤU trong DD: TỬ + – + – RNH3 OH +HCl RNH3 Cl + H2O
CƠ CHẾ TRAO ĐỔI ION Để ước lượng khả năng tách hai ion M1 , M2 ra khỏi nhau dùng hệ số tách với DUNG D DỊCH = M (1) (6) CHỨA DM (2) NHIỀU CẤU Nếu D >> D tức >> 1 thì cĩ thể TỬ M(1) M(2) tách M1 , M2 ra khỏi nhau trên loại nhựa đang xét
CƠ CHẾ TRAO ĐỔI ION Ái lực của nhựa đối với ion Nhựa sulphonate: Ái lực của nhựa tăng theo điện tích của cation DUNG Na+ < Ca2+ < Al3+ < Th4+ DỊCH Đối với các cation cĩ cùng điện tích:ái lực CHỨA trao đổi tăng theo đường kính (đã hydrate NHIỀU hĩa) của cation khi dung dịch lỗng: CẤU + + + + + + + + 2+ TỬ Li <H <Na <NH4 =K <Rb <Cs <Ag <Mg Û Mg2+<Ca2+<Sr2+ < Ba2+; Al3+< Fe3+ Nếu dd đậm đặc: ái lực trao đổi cation giảm dần và thứ tự cĩ thể bị thay đổi
CƠ CHẾ TRAO ĐỔI ION Ái lực của nhựa đối với ion Nhựa ammonium tứ: F–<OH–<Cl–<CN–<Br–<NO –<I–<SCN–<ClO – DUNG 3 4 DỊCH Nhựa phosphate: CHỨA NHIỀU Ba2+<Sr2+<Mg2+<Ca2+<Ni2+<Co2+<Cd2+ 2+ 2+ 2+ 2+ CẤU < Zn <Cu <Pb < Be TỬ Nhựa amino diacetate: K+<Na+<Li+<Sr2+<Ba2+<Mg2+<Ca2+<Zn2+ <Cd2+<Ni2+<Pb2+ < Cu2+ <Hg2+
KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM Cho nhựa vào DD k/sát, khuấy đều. Sau khi CB trao đổi xảy ra, Tách dùng biện pháp thích hợp để tách rời hai pha. Chỉ áp dụng tĩnh được cho trường hợp DD k/sát KỸ chứa các ion kim loại cĩ hệ số THUẬT phân bố giữa hai pha khác nhau TÁCH rõ rệt Dùng cột sắc ký, tách các cấu tử Tách theo một trong ba cách: tiền lưu, động đẩy và rửa giải
KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM Cột thủy tinh cĩ L/dtr >10 Ở đáy ống cĩ khố để CỘT SẮC DD thốt ra. Để tránh KÝ ionit làm nghẽn cột, TRAO phần dưới của cột ĐỔI ( b ) ION thường để bi thủy tinh (a) hoặc bơng thủy tinh Cột trao đổi ion: a) Hở phía trên; dày 3 -10mm b) Đĩng bằng phễu nhỏ giọt
KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM Chuẩn bị cationit Ngâm trương nhựa trong dd NaCl bão hịa THỰC Ngâm tiếp vào DD NaOH 5% (3-4 giờ). HIỆN Gạn DD kiềm, ngâm tiếp trong kiềm mới, QUÁ cho đến khi DD gạn ra khơng cịn màu TRÌNH Rửa sạch kiềm bằng nước cất, HCl 5% rồi TÁCH HCl 10%, HCl 15% cho đến khi khơng cịn 3+ Fe (thử bằng K4Fe(CN)6) Rửa bằng nước cất đến hết Cl – tự do, + hết ion H Chương 7
KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM Chuẩn bị cationit Nếu sử dụng cationit trong sinh hĩa, dược, + THỰC thực phẩm , sau khi rửa hết ion H tự do HIỆN phải rửa tiếp cationit bằng dung dịch H2O2 QUÁ 5%, cồn etylic 95% và acetone TRÌNH TÁCH Chuyển cationit về dạng R- H bằng dung dịch HCl 5% và sau đĩ cũng phải rửa hết ion H+ tự do
KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM Chuẩn bị anionit Ngâm trương nhựa trong dd NaCl bão hịa, rửa nhựa bằng dd HCl 2% cho sạch Fe3+ THỰC Rửa tiếp bằng dd NaOH 5% và nước cất HIỆN QUÁ Anionit base mạnh chứa nhiều tạp chất TRÌNH hữu cơ gây cản trở cho quá trình tách, TÁCH cần rửa thêm với cồn etylic Khơng nên giữ anionit quá lâu ở dạng R-OH, vì ở dạng này anionit kém bền, nhất là ở nhiệt độ cao hơn 300C Chương 7
KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM Chuẩn bị cột Sau khi được ngâm trương và làm sạch, rĩt ionit vào cột cùng với nước để tránh sự xuất THỰC hiện của bọt khí bao quanh hạt ionit (chiếm HIỆN khoảng 2/3 thể tích cột). Phía trên của ionit để QUÁ thêm một lớp bơng thủy tinh TRÌNH TÁCH Ionit đã được làm sạch và làm khơ để bảo quản thì vẫn phải được ngâm trương trong nước trước khi cho vào cột Chương 7
KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM Trao đổi trên cột Cho dung dịch khảo sát qua cột nhựa (2– 3 ml / phút). Nên sử dụng lượng ionit thừa THỰC một ít so với tính tốn HIỆN QUÁ Rửa giải TRÌNH (Giải hấp ion ra khỏi ionit) TÁCH Bằng acid cĩ nồng độ khác nhau, hoặc một số chất hữu cơ cĩ khả năng tạo phức với ion cần tách . Rửa tiếp ionit bằng các dd thích hợp để đuổi hết dung dịch giải hấp ChươngChương 7 7
KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM Tái sinh cột Cho chảy qua cột dd HCl Cationit 2- 4% (nhựa RH), hoặc dd THỰC NaCl 2 - 4% (nhựa RNa) HIỆN Cho qua cột dd NaOH 2- 4% QUÁ TRÌNH Anionit (nhựa RNH2 ) hay dd HCl, TÁCH NaCl 2 - 4% (nhựa RCl) Việc tái sinh ionit nên thực hiện lại vào giai đoạn đầu của quá trình sắc ký Chương 7
KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM Dung lượng trao đổi ion của ionit Biểu diễn bằng số mili đương lượng phân tử mà ionit cĩ thể trao đổi tính cho một đơn vị khối lượng hay một đơn vị thể tích XĐ của ionit (phổ biến nhất là mđlg/ g): MỘT SỐ Dung lượng trao đổi tĩnh: cho một lượng ĐẶC ionit XĐ vào một thể tích khơng đổi DD TRƯNG bão hịa ion, lắc mạnh cho đến khi nhựa CỦA trở nên bão hịa ion. Thường sử dụng để IONIT XĐ dung lượng trao đổi tồn phần, dung lượng trao đổi theo từng nhĩm trao đổi và dung lượng trao đổi CB trong những điều kiện khác nhau
KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM Dung lượng trao đổi ion của ionit Dung lượng trao đổi động: cho DD bão hịa ion chảy liên tục qua một lớp ionit xác định chứa trong cột XĐ MỘT Dung lượng trao đổi được XĐ khi bắt SỐ đầu xuất hiện ion trao đổi đầu tiên trong ĐẶC dung dịch thốt ra ngồi cột. TRƯNG PP được sử dụng để XĐ dung lượng trao CỦA đổi tồn phần (tương ứng thời điểm DD IONIT đi ra khỏi cột đã bão hịa ion trao đổi) và tốc độ trao đổi ion của ionit. Lưu ý chỉ điều chỉnh khĩa một lần để cố định vận tốc qua cột
CHƯƠNG 20 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ 20.4 SẮC KÝ RÂY PHÂN TỬ – Nguyên tắc – Hệ sắc ký rây phân tử – Kỹ thuật thực nghiệm & ứng dụng
NGUYÊN TẮC Sắc ký rây phân tử (sắc ký gel, sắc ký thẩm thấu gel, lọc gel ) là PP tách dựa trên sự khác nhau về kích thước phân tử của các chất: Cho DDPT đi qua các vật liệu cĩ khả năng tạo thành bộ khung gel hoặc các rây phân tử. φS là dung mơi ở trong các lỗ của gel, cịn φm cũng chính là dung mơi chạy qua Các phân tử cĩ kích thước lớn hơn lỗ gel chỉ khuếch tán vào các kẽ hở giữa các hạt rắn xốp, cịn các phân tử cĩ kích thước bé hơn “cửa sổ “ cĩ thể đi xuyên vào các lỗ của gel vào sâu bên trong
NGUYÊN TẮC Khi φm đi ngang qua, các cấu tử được rửa giải theo thứ tự giảm dần của kích thước phân tử (các phân tử cĩ kích thước lớn hơn lỗ gel sẽ theo φm ra đầu tiên) Phân tử cĩ cấu trúc khơng gian gần giống nhau, thứ tự rửa giải sẽ giảm theo chiều giảm M
HỆ SẮC KÝ RÂY PHÂN TỬ Phổ biến nhất hiện nay bao gồm các khung gel hữu cơ (dextran, polyacrylamit, CÁC polyvinylacetate, polystirol ) và rây phân LOẠI tử vơ cơ (zeolite tổng hợp, thủy tinh xốp, GEL silicagel đại xốp ) VÀ RÂY PHÂN Zeolite tổng hợp được dùng để tách chất khí. TỬ Các chất xốp vơ cơ, hữu cơ, polymer tổng hợp dùng tách các chất vơ cơ và hữu cơ, cịn các nhĩm polymer ưa nước dùng để tách các chất cĩ hoạt tính sinh học
HỆ SẮC KÝ RÂY PHÂN TỬ Dung mơi (khơng quan trọng lắm), cĩ thể là: PHA Dùng tách các biopolymer, TĨNH Nước rượu polyvinylic VÀ PHA tách cao su, polystyrol, ester ĐỘNG Toluene polyvinylic tách silicon, nhựa epoxy, Chloroform polyeter béo
KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM Tương tự với thiết bị dùng trong các dạng LC khác: THIẾT Dùng cột sắc ký thơng thường (bằng thủy BỊ tinh L= 20 – 200cm, d = 5 – 50mm) Hoặc dùng máy HPLC để phân tích
KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM Nạp gel hoặc các rây phân tử vào cột dưới hình thức “vữa” và gõ nhẹ Mở khĩa cho dung mơi chảy qua cột, luơn luơn giữ lại một ít dung mơi trên gel hoặc các rây phân tử để khơng khí khơng lọt vào CÁCH TIẾN Đưa mẫu vào bằng micropipet hoặc bơm vi HÀNH lượng trong lúc d/mơi vẫn tiếp tục đi qua (đặt bình hứng cĩ chia độ ở phía dưới cột) (thường tách riêng từng phân đoạn 0,5 – 1,0 ml dung dịch đi ra ứng với các kích thước phân tử khác nhau)
CHƯƠNG 20 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ 20.5 SẮC KÝ TRÊN BẢN MỎNG – Nguyên tắc – Hệ sắc ký bản mỏng – Kỹ thuật thực nghiệm – Định tính & định lượng
NGUYÊN TẮC Nguyên tắc tương tự sắc ký hấp phụ trên cột, nhưng sự hình thành sắc đồ được tiến hành trên bản phẳng Tuyến dung Vị trí A, B X’ mơi ở cuối ban đầu Đại lượng đặc trưng thí nghiệm cho QT di chuyển của A các cấu tử là hằng số B X phân bố vùng Dung Tuyến xuất R (A) = x / x’ mơi phát của f dung mơi Sắc đồ của dd chứa 2 cấu tử A, B được tác bằng SK bản mỏng
HỆ SẮC KÝ BẢN MỎNG Bản Bằng thủy tinh / lá nhơm / lớp màng polyester. Dùng kính (mờ) tốt nhất vì cĩ thể rửa sạch dễ dàng, sử dụng lại được và bền với các thuốc thử hiện màu Pha tĩnh Pha tĩnh cĩ thể là silicagel, oxyd nhơm , xenlu- lose, tinh bột, sephadex (rây phân tử) và cả nhựa trao đổi ion được trãi thành lớp mỏng trên bản Chương 7
HỆ SẮC KÝ BẢN MỎNG Pha động Thường dùng hỗn hợp hai hay ba dung mơi để làm pha động Ví dụ, để tách các acid amin người ta dùng hỗn hợp n – butanol với acid acetic và nước làm dung mơi. Khi phân tích các ion vơ cơ người ta dùng dung dịch đệm (trong nước) cĩ pH xác định
CÁCH TIẾN HÀNH Làm sạch bề mặt kính: ngâm vào nước cất, CHUẨN rửa bằng dung dịch rửa thích hợp (ví dụ BỊ như sulphochromic), làm sạch hết chất mỡ, BẢN rửa sạch lại bằng nước cất và sấy khơ Với pha tĩnh khơng dính, trãi pha tĩnh lên mặt kính rồi dùng trục lăn cán pha tĩnh thành lớp mỏng CHUẨN BỊ Với lớp pha tĩnh dính, cĩ thể sử dụng biện PHA pháp quét vữa, tưới vữa, nhúng bản vào TĨNH vữa hoặc phun vữa lỗng lên bản (các mép của tấm kính được chừa trống khơng phủ vữa khoảng 5mm)
CÁCH TIẾN HÀNH Lượng mẫu thích hợp từ 0,1µg đến 50µg DD (dung mơi là eter, chloroform, nước ) ĐƯA Thể tích dung dịch chấm lên bản từ 0,001ml MẪU đến 0,005ml (chấm dưới dạng điểm) và từ LÊN 0,1 – 0,2 ml (dưới dạng vạch, tức điểm này BẢN chấm cạnh điểm kia) Mẫu phải được lấy bằng mao quản thủy tinh hoặc micropipet cĩ độ chính xác cao
CÁCH TIẾN HÀNH Kẽ 2 đường bút chì cách mép trên và mép dưới của bản mỏng 2 – 3 cm Dùng pipet Pasteur nhỏ dd phân tích trên đường xuất phát cách rìa bản 2 – 3 cm ĐƯA MẪU LÊN BẢN
CÁCH TIẾN HÀNH PP sắc ký đi lên Đặt bản trong bình sắc ký -bình thủy tinh cĩ nút nhám- chứa dung mơi, mức dung mơi ngập bản khoảng 0,5 – 0,7 cm (dưới điểm xuất phát 0,8 – 1,0 cm) (nghiêng 150 CÁCH và dựa vào thành bình) hoặc treo trong TRIỂN bình bằng mĩc KHAI SẮC ĐỒ
CÁCH TIẾN HÀNH PP sắc ký đi lên Khoảng đường di chuyển của dung mơi qua bản <10-12cm vì sau đĩ tốc độ chuyển động CÁCH của dung mơi rất chậm, vết sắc ký bị loang TRIỂN rộng và Rf bị dao động nhiều KHAI SẮC Đến chiều cao thích hợp, lấy bản ra khỏi bình, ghi nhận tuyến dung mơi, làm khơ ĐỒ bản, cho hiện màu nếu cần
CÁCH TIẾN HÀNH PP sắc ký đi lên CÁCH TRIỂN KHAI SẮC ĐỒ
CÁCH TIẾN HÀNH PP sắc ký đi xuống 0 Dung - 0 mơi 0 CÁCH TRIỂN Phương pháp sắc ký KHAI đi xuống SẮC ĐỒ Dung mơi thấm vào bản nhờ băng giấy nối với bản và nhúng vào lọ dung mơi (được treo bằng mĩc), chuyển động từ trên xuống dưới do tác dụng của lực mao quản và lực trọng trường
CÁCH TIẾN HÀNH PP sắc ký nằm ngang CÁCH TRIỂN KHAI SẮC ĐỒ Để dung mơi bay hơi tự do, dưới tác dụng của lực mao quản, dung mơi sẽ chuyển động hướng từ tâm ra ngồi và các cấu tử sẽ phân bố trên bản mỏng dưới dạng các vịng đồng tâm
CÁCH TIẾN HÀNH PP sắc ký đa bậc CÁCH TRIỂN Kỹ thuật tách được tiến hành với nhiều KHAI dung mơi (được sử dụng theo thứ tự độ SẮC phân cực tăng dần) ĐỒÀ Giá trị Rf sẽ tính riêng đối với từng dung mơi
CÁCH TIẾN HÀNH PP sắc ký hai chiều (vuơng gĩc) Dung mơi thứ hai B C D Dung B,C, mơi D thứ A nhất CÁCH A,B,C, TRIỂN D KHAI PPP sắc ký hai chiều SẮC ĐỒÀ Khi DD phân tích chứa 10 cấu tử trở lên, thường dùng PP sắc ký hai chiều để tách chúng: sau khi cho chạy một chiều với dung mơi thứ nhất, xoay bản 900 và chạy tiếp với hệ dung mơi thứ hai
CÁCH TIẾN HÀNH Đối với những chất được sắc ký khơng màu hoặc cĩ màu rất nhạt thì sau khi triển khai phải làm hiện sắc đồ bằng PP HIỆN thích hợp (hố học, quang học, phĩng xạ ) SẮC ĐỒ Cách phổ biến nhất là phun thuốc hiện màu lên tồn bản dưới dạng các hạt sương rất nhỏ
ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG So sánh chuẩn với mẫu ngay trên cùng một bản sắc ký để đảm bảo điều kiện ĐỊNH tách giống hệt nhau TÍNH Nên tiến hành thí nghiệm với Rf nằm trong khoảng từ 0,1 đến 0,8
ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG Định lượng trực tiếp trên sắc đồ Đánh giá diện tích S của sắc đồ hoặc cường độ của vết màu xuất hiện bằng mắt thường hoặc dùng máy đo - Pha tĩnh ở trạng thái rắn được trãi thành ĐỊNH lớp mỏng trên các bản thủy tinh, bản kim LƯỢNG loại hay chất dẻo - Phương pháp đo S : trong khoảng lượng chất sử dụng m = 1 - 100μg, giữa m và diện tích S cĩ quan hệ tuyến tính sau đây: S = a lg m + b (7) a, b – hằng số thực nghiệm
ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG Định lượng trực tiếp trên sắc đồ Xây dựng đồ thị S = f(lg m) đối với các DD chuẩn cĩ nồng độ khác nhau Xác định nồng độ mẫu dựa vào đường ĐỊNH chuẩn hoặc bằng PP bình phương cực tiểu LƯỢNG Ngồi ra, cịn cĩ thể dùng: + PP densitomet + PP huỳnh quang + PP đo độ phĩng xạ để định lượng trực tiếp trên sắc đồ
ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG PP tách chất khỏi sắc đồ Chuyển tất cả phần chất cần phân tích ĐỊNH trên bản mỏng vào bình và dùng PP thích LƯỢNG hợp (đo màu, đo huỳnh quang, cực phổ, sắc ký khí ) để xác định hàm lượng chất
CHƯƠNG 20 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ 20.6 SẮC KÝ GIẤY – Nguyên tắc – Hệ sắc ký giấy – Cách tiến hành – Định tính & định lượng
NGUYÊN TẮC Sắc ký giấy thuộc dạng sắc ký phân bố lỏng lỏng mà chất mang pha lỏng là giấy sắc ký Trong quá trình sắc ký các cấu tử được tách dọc theo lớp mỏng của tờ giấy Cĩ thể áp dụng lý thuyết tách trong sắc ký phân bố trên cột cho sắc ký giấy
HỆ DUNG MƠI SẮC KÝ GIẤY Giấy sắc ký phải tinh khiết hố học, trơ với các cấu tử của DD và dung mơi sắc ký, đồng nhất về tỷ trọng để dung mơi di chuyển với vận tốc nhất định, cĩ hướng sợi trùng với hướng chuyển động của dung mơi Giấy sắc ký thuộc loại hydrophyl ưa nước (hấp phụ ẩm trong khơng khí đến 20 -25% khối lượng giấy) nên nếu ưS lỏng là nước, khơng cần làm ẩm giấy trước φS Nếu φS lỏng là chất hữu cơ, phải tẩm giấy bằng các chất kỵ nước như parafin, dầu thực vật
HỆ DUNG MƠI SẮC KÝ GIẤY Dung mơi động và dung mơi tĩnh phải khơng trộn lẫn. Để tách tốt, các cấu tử của mẫu khảo sát phải cĩ tính tan khác nhau rõ rệt trong hệ dung mơi đã chọn Tính tan của các cấu tử trong φm phải bé hơn tính tan của chúng trong φS và nĩi chung là nên ở mức vừa phải Để tách các chất tan trong nước, thường chọn φm là dung mơi hữu cơ cịn φS là nước. Ngược lại, tách các chất tan trong dung mơi hữu cơ, φm là nước và φS là dung mơi hữu cơ
CÁCH TIẾN HÀNH SẮC KÝ GIẤY Tương tự phương pháp sắc ký bản mỏng. Cách định tính và định lượng cũng hồn tồn tương tự Ngồi ra, cĩ thể kết hợp PP sắc ký giấy với PP điện di (điện di trước sắc ký sau) cho kết quả tách rất cao