Phương pháp phổ UV-VIS - Lê Nhất Tâm

Nội dung text: Phương pháp phổ UV-VIS - Lê Nhất Tâm

1. Lê Nhất Tâm – UIH- IBF Email: lenhattam@iuh.edu.vn
2. PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV-VIS Các nội dung chính + Vùng phổ UV-Vis và nguồn gốc của sự hấp thụ + Phổ UV-Vis + Sự chuyển dịch điện tử của các hợp chất hửu cơ + Nhóm chức + Các yếu tố ảnh hưởng đến bước sóng hấp thụ + Hệ thống thiết bị quang phổ UV-Vis + Các loại máy quang phổ + Ứng dụng phổ UV-Vis trong phân tích thực phẩm
3. PHƯƠNG PHÁP PHỔ UV-VIS • Vùng phổ UV-Vis là vùng nằm ở cận UV cho đến cận IR. Có bước sóng từ khoảng 180-1100nm. • Đây là vùng phổ đã được nghiên cứu nhiều và được áp dụng nhiều về mặt định lượng. • Nhiều thế hệ thiết bị ra đời, và ngày một hoàn thiện. • Phương pháp phổ UV-Vis còn được nghiện cứu ở lĩnh vực kết hợp
4. NGUỒN GỐC CỦA SỰ HẤP THỤ • Vùng phổ này thường được chia làm 3 vùng chủ yếu: cận UV (185–400 nm), khả kiến (400–700 nm) và cận hồng ngoại (700–1100 nm). • Nguồn gốc của sự hấp thụ trong vùng này chủ yếu là sự tương tác của các photon của bức xạ với các phân tử của mẫu. • Sự hấp thụ chỉ xãy ra khi có sự tương ứng giữa năng lượng photon và năng lượng các điện tử tạo liên kết hay điện tử tự do. • Kết quả của sự hấp thụ là có sự biến đổi năng lượng điện tử của phân tử. Chính vì vậy phổ UV-Vis được gọi là phổ điện tử
5. PHỔ UV-VIS VÀ NGUỒN GỐC CỦA SỰ HẤP THỤ
6. PHỔ UV-VIS • Sự hấp thụ năng lượng điện tử trong vùng sóng ánh sáng tử ngoại gần (190-400nm) và khả kiến (400- 780nm) của các chất gây ra sự chuyển dịch của các điện tử từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích. • Biểu đồ biển diễn sự tương quan giữa cường độ hấp thu theo bước sóng của một chất được gọi là phổ UV-Vis của chất ấy trong điều kiện xác định
7. SỰ CHUYỂN DỊCH ĐIỆN TỬ CỦA CÁC HỢP CHẤT HỬU CƠ • Phần lớn các hợp chất hửu cơ được nghiên cứu trong vùng phổ UV-Vis. • Quá trình chuyển tiếp bao gồm các điện tử π , σ or hay điện tử n nằm trên các orbital của các nguyê tử nhẹ như H, C, N, O
8. SỰ CHUYỂN DỊCH ĐIỆN TỬ CỦA CÁC HỢP CHẤT HỬU CƠ CHUYỂN MỨC σ →σ* • Sự chuyển vị của e trong liên kết σ của các hợp chất hửu cơ từ orbital liên kết σ lên phản liên kết σ*. • Sự chuyển vị này đòi hỏi một năng lượng khá lớn, vì vậy quá trình chuyển vị nằm trong vùng tử ngoại xa ( UV).
9. SỰ CHUYỂN DỊCH ĐIỆN TỬ CỦA CÁC HỢP CHẤT HỬU CƠ CHUYỂN MỨC n → σ* • Sự chuyển vị của các điện tử từ obital n lên các orbital σ* trong các nguyên tử như O, N, S . • Xãy ra ở vùng phổ tử ngoại gần có cường độ không lớn. Sự dịch chuyển này dao động ở 180nm cho alcol, dẫn xuất halogen của nó là 190nm. Đối với các amin là 220nm Ví dụ : Ete có λmax= 190nm ( ε =2000) Metanol có λmax= 183nm ( ε =50) Etylamin có λmax= 210 nm ( ε =800)
10. SỰ CHUYỂN DỊCH ĐIỆN TỬ CỦA CÁC HỢP CHẤT HỬU CƠ CHUYỂN MỨC n → σ*
11. SỰ CHUYỂN DỊCH ĐIỆN TỬ CỦA CÁC HỢP CHẤT HỬU CƠ CHUYỂN MỨC n→ π* • Quá trình thường xãy ra ở phân tử có chứa các nguyên tử, trên bề mặt các nguyên tử này chứa điện tử không liên kết. Ví dụ phân tử chứa nhóm chức cacbonyl (C=O) và bước sóng hấp thu tử 270nm- 295nm. Cường độ hấp thu thấp của quá trình thấp • Dung môi có ảnh hưởng đến bước sóng hấp thu vì nó tác động đến liên kết trong phân tử. • Ví dụ: Ethanal có bước sóng hấp thu là 293nm
12. SỰ CHUYỂN DỊCH ĐIỆN TỬ CỦA CÁC HỢP CHẤT HỬU CƠ CHUYỂN MỨC π→π* • Các hợp chất đồng phân với etylen chứa liên kết đôi trong phân tử có khả năng hấp thu mạnh trong khoảng bước sóng 170nm • Vị trí hấp thu phụ thuộc vào sự hiện diện của nhóm thế ví dụ etylen có λmax= 165nm (ε =16000) • Những hợp chất không màu thường có phổ hấp thu trong vùng cận tử ngoại. Khi chúng hấp thu bức xạ thì chúng sẽ chuyển từ orbital cho điện tử sẽ chuyển lên orbital nhận điện tử có mức năng lượng cao hơn.
13. SỰ CHUYỂN DỊCH ĐIỆN TỬ CỦA CÁC HỢP CHẤT HỬU CƠ TÓM TẮC CÁC BƯỚC CHUYỂN
14. SỰ CHUYỂN DỊCH ĐIỆN TỬ CỦA CÁC HỢP CHẤT HỬU CƠ CHUYỂN MỨC d d • Sự chuyển mức xãy ra ở các orbital d, nhất là ở các kim loại vùng chuyển tiếp • Các phối tử có cặp điện tử tự do tham gia lai hóa với những orbital này chuyển điện tử vào các orbital này gây ra sự chuyển mức. • Màu tạo ra của các phức làm cho phức có khả năng hấp thu những bước sóng ở vùng khả kiến
15. CÁC NHÓM CHỨC • Nhóm chức là những nhóm nhỏ được tạo thành từ nhiều nguyên tử, quyết định tính chất của hợp chất hửu cơ. • Tại vị trí các nhóm chức trong phân tử các dịch chuyển điện tử xãy ra, nên phổ đồ của phân tử hửu cơ liên quan tới các nhóm chức trong phân tử. • Người ta đã tìm được các bước sóng hấp thu cực đại cho từng nhóm chức.Từ đó có thể dự đoán sự tồn tại của các nhóm chức thông qua độ hấp thu của nó.
16. NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI SỰ CHUYỂN MỨC • Ảnh hưởng của dung môi • Ảnh hưởng của sự liên hợp • Ảnh hưởng của pH
17. NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI SỰ CHUYỂN MỨC ẢNH HƯỞNG CỦA DUNG MÔI • Bước sóng hấp thu và cường độ hấp thu của các hợp chất chịu ảnh hưởng của dung môi. • Sự tác động của những dung môi khác nhau lên các phân tử làm thay đổi mức năng lượng giửa các trạng thái kích thích và cơ bản. • Sự tác động của dung môi lên phân tử làm sinh ra :chuyển dịch xanh và chuyển dịch đỏ
18. NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI SỰ CHUYỂN MỨC CHUYỂN DỊCH XANH • Là hiện tượng hấp thu bức xạ của các hợp chất hửu cơ có bước sóng ngắn hơn trong những dung môi có tính phân cực cao • Hiện tượng tìm thấy ở quá trình chuyển dịch n→ π* của nhóm cacbonyl. • Nguyên nhân là do sự làm bền trạng thái n của dung môi.
19. NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI SỰ CHUYỂN MỨC
20. NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI SỰ CHUYỂN MỨC CHUYỂN DỊCH ĐỎ • Là hiện tượng các hợp chất hửu cơ có xu hướng hấp thu những bức xạ có bước sóng dài hơn trong những dung môi có độ phân cực cao hơn • Hiện tượng được tìm thấy ở các phân tử hửu cơ mà trong cấu trúc phân tử của nó có sự liên hợp.
21. NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI SỰ CHUYỂN MỨC CHUYỂN DỊCH ĐỎ • Nguyên nhân của hiện tượng này là: + Do khi trong mạch C có hiệu ứng liên hợp , hiệu ứng này sẽ dẫn tới làm bền trạng thái π*. Điều này dẫn tới năng lượng giữa hai trạng thái giảm. + Trong phân tử hửu cơ có hiệu ứng liên hợp càng dài thì bước sóng hấp thu càng lớn
22. NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI SỰ CHUYỂN MỨC CHUYỂN DỊCH ĐỎ
23. NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI SỰ CHUYỂN MỨC TÓM TẮC CHUYỂN DỊCH XANH VÀ CHUYỂN DỊCH ĐỎ
24. NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI SỰ CHUYỂN MỨC ẢNH HƯỞNG CỦA pH • Ảnh hưởng độ bền của phức • Ảnh hưởng đến sự tạo phức • Ảnh hưởng dạng tồn tại
25. NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI SỰ CHUYỂN MỨC Ảnh hưởng của sự liên hợp Sự liên hợp p-π hay π- π đều làm cho trạng thái kích thích của điện tử π* bền hơn có năng lượng thấp hơn đều này dẫn tới bước sóng hấp thu dài hơn
26. THIẾT BỊ QUANG PHỔ HẤP THU UV-VIS
27. NGUỒN SÁNG Nguồn sáng có nhiệm vụ cung cấp bức xạ tương thích với quá trình đo. Bức xạ được cung cấp bởi nguồn sáng thường là chùm bức xạ đa sắc, nó bao trùm một khoảng rộng của phổ.
28. TUNGSTEN LAMP + Đèn Tungsten Halogen , là một nguồn sáng phổ biến dùng trong máy quang phổ. Đèn này chứa một sợi dây mảnh tungsteng được đặt trong thủy tinh. Khoảng bức xạ mà đèn cung cấp là từ 330 đến 900 nm, được dùng trong vùng visible. +Thời gian sử dụng đèn này khoảng 1200h. + Với U= 6v và cường độ rất lớn dây tungten bị nung đỏ đưa bầu khí trơ ( Neon, Argon) lên trạng thái kích thích và phát bức xạ
29. Hydrogen / Deuterium Lamps + Đèn hydrogen or deuterium cung cấp bức xạ trong vùng Ultraviolet tương ứng với dãi bức xạ từ 200 đến 450 nm. + Trong hai đèn thì đèn Deuterium ổn định hơn và có thời gian sử dụng khoảng 500h. Đây là đèn cho phổ liên tục
30. Hydrogen / Deuterium Lamps
31. THIẾT BỊ TẠO BỨC XẠ ĐƠN SẮC • Thu nhận chùm bức xạ đa sắc phát ra từ đèn, và cho bức xạ đơn sắc đi ra • Có hai loại thiết bị phổ biến gồm lăng kính và cách tử
32. THIẾT BỊ TẠO BỨC XẠ ĐƠN SẮC Lăng kính (Prism) + Những bức xạ có bức sóng khác nhau sẽ bị bẻ gảy những góc khác nhau khi đi ra khỏi lăng . + Lăng kính có thể được làm từ thủy tinh hay thạch anh. + Tùy thuộc vào vật liệu làm lăng lính mà nó có thể tách những bức xạ trong vùng nào (Lăng kinh thủy tinh phù hợp với các bức xạ trong vùng visible nhưng lăng kính thạch anh thì bao phủ ở cả hai vùng Ultraviolet và Visible) .
33. THIẾT BỊ TẠO BỨC XẠ ĐƠN SẮC CÁCH TỬ (GRATINGS) + Cách tử được cấu tạo với vô số những khe rất nhỏ trên một diện tích bề mặt khoảng 200-1000 khe trên một độ rộng 1cm + Tùy thuộc vào góc tới của chùm ánh sáng và bề mặt cách tử mà hướng truyền của chùm bức xạ khi phản xạ trên bề mặt cách tử theo những hướng khác nhau
34. THIẾT BỊ TẠO BỨC XẠ ĐƠN SẮC CÁCH TỬ (GRATINGS) Phân loại cách tử: + Cách tử truyền suốt: Được làm bằng thủy tinh + Cách tử phản xạ : Làm bằng nhôm
35. THIẾT BỊ TẠO BỨC XẠ ĐƠN SẮC + Phần bị rạch không phản chiếu ánh sáng, phần còn lại đóng vai trò một gương phẳng gồm nhiều gương riêng biệt nhau. + Ánh sáng chiếu tới phần mạ nhôm không bị rạch này sẽ bị phản xạ trở lại theo những góc khác nhau tùy thuộc vào bước sóng của chúng. + Các tia phản xạ sẽ giao thoa với nhau tạo nên vân nhiễu xạ có bước sóng khác nhau. + Khi quay cách tử, ta thu được ở khe ra các vân có bước sóng khác nhau. + Cách tử phản xạ ánh sáng ở những bậc khác nhau nên phải dùng kính lọc để chỉ cho ánh sáng của bậc ánh sáng phản xạ mong muốn đến đầu dò
36. THIẾT BỊ TẠO BỨC XẠ ĐƠN SẮC Quan sát phổ qua cách tử
37. ƯU ĐIỂM CỦA CÁCH TỬ SO VỚI LĂNG KÍNH + Cho độ phân giải tốt hơn + Cho sự tán sắc tuyến tính + Độ rộng của giải phổ là hằng tính + Cơ chế chọn bước sóng đơn giản hơn
38. BỘ PHẬN CHỨA MẪU(CUVETTES) + Được làm bằng chất liệu sao cho ánh sáng trong vùng đo phải truyền qua (trong thực tế các loại cóng đo có độ truyền tối đa là khoảng 90% ở mọi bước sóng trong vùng UV-Vis) + Trong vùng tử ngoại (dưới 350 nm) dùng dùng cốc làm bằng thạch anh hay silica (silic dioxid) nóng chảy.
39. BỘ PHẬN CHỨA MẪU(CUVETTES) • Trong vùng khả kiến dùng dùng Cuvette làm bằng thủy tinh silicat hoặc bằng chất dẽo (nhựa acrilic). • Quang lộ Cuvettes đo thông thường nhất là 1 cm. • Ngoài ra còn có các cóng đo có quang lộ từ 0,1 đến 10 cm dùng cho các nồng độ thích hợp mà không cần pha loãng tiếp theo.
40. THIẾT BỊ NHẬN BIẾT(DETECTORS) + Có tác dụng cảm nhận bức xạ điện từ sau khi bị hấp thụ và chuyển lượng bức xạ này thành dòng điện. + Cường độ dòng điện thu được là tỷ lệ thuận với cường độ bức xạ đập vào bề mặt catot. + Tế bào quang điện hay Ống nhân quang điện là những thiết bị hửu dụng trong việc đo xác định
41. THIẾT BỊ NHẬN BIẾT(DETECTORS) Tế bào quang điện
42. THIẾT BỊ NHẬN BIẾT(DETECTORS) ỐNG NHÂN QUANG ĐIỆN ◼ Nguyên tắc hoạt động gần giống tế bào quang nhưng có thêm bộ khuếch đại bên trong làm cho loại này có độ nhạy lớn hơn trên thang phổ rộng hơn. ◼ Ánh sáng gây ra sự bức xạ photon từ photocathod, giống như trong tế bào quang nhưng anod được sắp xếp thành dãy dynod có thể tăng lên không ngừng. ◼ . Bản chất của nguyên liệu làm cathode là xác định độ nhạy của phổ.
43. CÁC LOẠI MÁY QUANG PHỔ Có hai loại : Máy một chùm tia và hai chùm tia Máy một chùm tia + Máy quang phổ chùm tia đơn là được phát minh ra đầu tiên, và toàn bộ ánh sáng đi qua mẫu. + Loại này là rẻ hơn vì nó được thiết kế khá đơn giản
44. CÁC LOẠI MÁY QUANG PHỔ Máy một chùm tia Ưu điểm của máy một chùm tia : Giá thành thấp, thông lượng bức xạ đi qua cao và như vậy độ nhạy cao. Nhược điểm: là có khoảng lệch thời gian khi tiến hành đo giữa các chuẩn cũng như mẩu xác định, vì vậy có thể có vấn đề với độ trôi. Điều này đã xãy ra với những thiết bị củ, những thiết bị hiện đại với những tính năng cao và ổn định đã khắc phục nhược điểm này. Vì vậy máy quang phổ một chùm tia vẫn có những ứng dụng cao trong các phòng thí
45. CÁC LOẠI MÁY QUANG PHỔ MÁY QUANG PHỔ DIODE ARRAY
46. CÁC LOẠI MÁY QUANG PHỔ Double beam + Thiết bị đo hai chùm tia nhằm mục đích khắc phục độ trôi xãy ra trong quá trình đo. Nguyên nhân gây ra độ trôi là cường độ ánh sáng bị mất đi trên đường truyền, do thay đổi đường đi, do phản xạ, do sự chuyển hóa thành dòng điện khi tương tác với detector. Sự mất đi này không đồng nhất khi đo mẫu blank và mẫu đo riêng biệt. + Trong thiết bị hai chùm tia có hai vị trí đo, tương ứng với mẫu blank và mẫu đo. Chùm tia sáng tới được phân tách thành hai chùm có cường độ bằng nhau, một chùm đi qua mẫu blank và một chùm đi qua mẫu đo.
47. CÁC LOẠI MÁY QUANG PHỔ Double beam
48. CÁC LOẠI MÁY QUANG PHỔ Double beam • Ưu điểm của thiết bị hai chùm tia Cho độ chính xác cao vì trong quá trình đo máy có thể kiểm soát được lượng ánh sáng đi qua mẫu đo, từ đó chúng ta có thể biết được có chính xác không. • Nhược điểm là giá thành cao, độ nhạy thấp do cấu trúc quang học phức tạp hơn, độ tin cậy thấp hơn.
49. ỨNG DỤNG PHỔ UV-VIS TRONG THỰC PHẨM • Phân tích protein • Phân tích Carbonhydrat • Phân tích hàm lượng kim loại trong thực phẩm • Phân tích một số chỉ tiêu nước
50. Định luật Lambert- Beer
51. Định luật Lambert- Beer
52. Định luật Lambert- Beer Một số sách ký hiệu K’ là Ɛ
53. HIỆU CHỈNH
54. Một số điều kiện cần nhớ khi áp dụng • Ánh sáng phải là ánh sáng đơn sắc • Nồng độ chất tan nhỏ • Dung dịch không được phát huỳnh quang hay lân quang • Chất tan trải qua phản ứng quang hóa • Chất tan không phản ứng với dung môi
55. SAI LỆCH TRONG ĐL LAMBERT - BEER • Định luật chỉ đúng với những dung dịch có nồng độ là thấp • Do nguồn sáng không thật là đơn sắc nên có lẫn những bức xạ có bước sóng lân cận nhiểm vào. Dẫn tới A= lg I/I0 không đúng