So sánh và đánh giá khả năng nhiễm chéo của vi khuẩn edwardsiella ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo mỹ trong điều kiện thực nghiệm

Nội dung text: So sánh và đánh giá khả năng nhiễm chéo của vi khuẩn edwardsiella ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo mỹ trong điều kiện thực nghiệm

1. Vietnam J. Agri. Sci. 2021, Vol. 19, No. 5: 605-615 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2021, 19(5): 605-615 www.vnua.edu.vn SO SÁNH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG NHIỄM CHÉO CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri PHÂN LẬP TỪ CÁ RÔ PHI VÀ CÁ NHEO MỸ TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC NGHIỆM Đoàn Thị Nhinh1, Đặng Thị Hóa1, Trần Thị Trinh1, Lê Việt Dũng1, Nguyễn Thị Hương Giang2, Kim Văn Vạn1, Đặng Thị Lụa3, Trương Đình Hoài1* 1Khoa Thủy sản, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 2Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, 3Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1 *Tác giả liên hệ: tdhoai@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 05.01.2021 Ngày chấp nhận đăng: 23.04.2021 TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện để so sánh và đánh giá khả năng nhiễm chéo của chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá rô phi và cá nheo Mỹ. Các chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo Mỹ nhiễm bệnh được so sánh về đặc điểm sinh hóa, giám định PCR, liều gây chết LD50 và khả năng gây nhiễm chéo cho loài cá còn lại. Kết quả cho thấy, chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo Mỹ khác nhau ở 2/22 phản ứng sinh hóa (citrate utilization, Voges-proskauer) nhưng tương đồng về kết quả định danh bằng PCR. 1 Chủng vi khuẩn E. ictaluri từ cá rô phi có độc lực rất cao cho loài cá này (LD50 = 2,5 × 10 CFU/cá) nhưng thể hiện 6 độc lực thấp khi được gây nhiễm chéo cho cá nheo Mỹ (LD50 = 2,0 × 10 CFU/cá). Tương tự, chủng vi khuẩn phân 3 lập từ cá nheo Mỹ có độc lực cao trên cá nheo Mỹ (LD50 = 4,7 × 10 CFU/cá) nhưng giảm độc lực đáng kể khi gây 6 nhiễm chéo cho cá rô phi (LD50 = 2,5 × 10 CFU/cá). Như vậy, vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá nheo Mỹ và cá rô phi là khác nhau, nhưng ở nồng độ cao vẫn gây chết khi gây nhiễm chéo, do đó cần có các biện pháp đảm bảo an toàn sinh học để tránh việc lây lan mầm bệnh giữa các hệ thống nuôi. Từ khóa: Edwardsiella ictaluri, rô phi, nheo Mỹ, độc lực, nhiễm chéo. Comparison and Evaluation of Cross-infection Possibility of Edwardsiella ictaluri Isolated from Tilapia and Channel Catfish under the Experimental Conditions ABSTRACT The study was conducted to compare and evaluate the cross-infection possibility of Edwardsiella ictaluri causing diseases in tilapia and Channel catfish. The strains of E. ictaluri isolated from tilapia and Channel catfish were compared based on the biochemical characteristics, PCR confirmation, lethal doses and the possibility of cross- infection among other fish species. The results revealed that E. ictaluri isolated from tilapia and Channel catfish differed in 2/22 biochemical reactions (citrate utilization, Voges-proskauer) but they were identical in PCR assay. The 1 virulence of E. ictaluri strains from tilapia was high when they were challenged to tilapia (LD50 = 2.5 10 CFU/fish) 6 but remarkably decreased to Channel catfish (LD50 = 2.0 10 CFU/fish). Similarly, the isolates from Channel catfish 3 exhibited a high virulence in this fish (LD50 = 4.7 10 CFU/fish) but reduced their pathogenicity to tilapia 6 (LD50 = 2.5 10 CFU/fish). The primary result demonstrates that E. ictaluri causing diseases in Channel catfish and tilapia differed in several characteristics. However, they cause relatively high mortality of fish when cross-infection among fish species at high bacterial densities. Thus, biosafety is required to avoid the spreading of pathogens in the culture systems. Keywords: Edwardsiella ictaluri, tilapia, Channel catfish, lethal dose, cross-infection ability. nên được người nuôi lựa chọn và dần trở thành 1. ĐẶT VẤN ĐỀ một trong những loài phổ biến ở khu vực phía Cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) là đối Bắc, đặc biệt là các mô hình nuôi lồng bè hiện tượng nuôi mới, lớn nhanh, có giá trị kinh tế cao đang được phát triển và mở rộng nhanh trên 605
2. So sánh và đánh giá khả năng nhiễm chéo của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo Mỹ trong điều kiện thực nghiệm sông và các hồ chứa (Trương Đình Hoài & cs., 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2020; Kim Văn Vạn, 2017). Cá rô phi (Oreochromis sp.) cũng là đối tượng nuôi truyền 2.1. Vật liệu nghiên cứu thống quan trọng của Việt Nam, đặc biệt có sự Cá rô phi (n = 40) và cá nheo Mỹ (n = 20) phát triển rộng khắp về diện tích nuôi ở nhiều nhiễm bệnh và các chủng vi khuẩn E. ictaluri tỉnh Miền Bắc trong những năm gần đây. Cá rô phân lập và giám định từ cá rô phi (n = 4) và cá phi được coi là đối tượng nuôi chủ lực, được tạo nheo Mỹ (n = 4) thu từ các vùng nuôi lồng khu điều kiện mở rộng quy mô nuôi và tăng sản vực phía Bắc Việt Nam năm 2020. Cá rô phi (cỡ lượng để phục vụ chế biến và xuất khẩu. Năm 30-40g) và cá nheo Mỹ (cỡ 40-50g) phục vụ đánh 2018, xuất khẩu cá rô phi đạt 7.900 tấn với tổng giá độc lực và cảm nhiễm chéo. Môi trường giá trị đạt khoảng 15,3 triệu USD. Năm 2019, Tryptic soya broth và Tryptic soya Agar (TSB và xuất khẩu cá rô phi đạt hơn 8.000 tấn với kim TSA; Merck). Bộ thuốc nhuộm vi khuẩn Gram ngạch 16 triệu USD. Bộ Nông nghiệp và Phát (Merck); kit chiết tách DNA thương mại Insta triển Nông thôn đã đề ra mục tiêu nâng sản Gene Matrix (Bio-Rad), GoTaq PCR green lượng cá rô phi từ 225.000 tấn (2017) lên (Promega) và các hóa chất, máy móc, thiết bị 400.000 tấn vào 2030, ở thời điểm này diện tích trong phòng thí nghiệm phục vụ trong kỹ thuật nuôi có thể tăng lên 40.000ha và 1,8 triệu m3 PCR, phân tích kết quả, hệ thống bể thí nghiệm nuôi lồng (MARD, 2019). Chính vì vậy, hiện nay và một số trang thiết bị dụng cụ cần thiết khác. các mô hình nuôi cá nheo Mỹ và cá rô phi đang phát triển mạnh, mang lại lợi nhuận cao, giải 2.2. Phương pháp nghiên cứu quyết sinh kế, mang lại thu nhập và giải quyết công ăn việc làm cho người dân địa phương. 2.2.1. Địa điểm và phương pháp thu mẫu Một vấn đề đặt ra hiện nay là dịch bệnh do Để thực hiện nghiên cứu, chúng tôi đã tiến Edwardsiella ictaluri đã và đang xuất hiện, gây hành thu thập mẫu cá nheo Mỹ và cá rô phi nuôi bệnh trên cả cá nheo Mỹ (Trương Đình Hoài & lồng trên sông và hồ chứa nhiễm bệnh, có dấu cs., 2020), cá rô phi (Dong & cs., 2019; Soto & hiệu hoại tử nội tạng và gây chết với tỷ lệ cao tại cs., 2012) tại Việt Nam. Tuy nhiên, sự xuất hiện một số tỉnh miền Bắc như Hưng Yên, Hải Dương, của vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh cho cả cá nheo Thái Bình và Hòa Bình. Mẫu được vận chuyển về Mỹ và cá rô phi có liên quan đến nhau hay và phân tích tại Phòng thí nghiệm Bệnh thủy không, vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh trên cá sản, Khoa Thủy sản, Học viện Nông nghiệp Việt nheo Mỹ và cá rô phi có giống nhau về đặc tính Nam, bằng phương pháp vận chuyển kín. Thời sinh học và có thể lây chéo cho nhau hay không gian thu thập mẫu và thực hiện các thí nghiệm là những câu hỏi cần được giải đáp để đề ra giải từ tháng 3 đến tháng 11/2020. pháp trong quá trình phòng trị bệnh trên các hệ thống nuôi hiện nay. 2.2.2. Phân lập vi khuẩn gây bệnh Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành Sau khi giải phẫu, tiến hành lựa chọn phân lập và giám định các chủng vi khuẩn những cá thể cá có dấu hiệu bệnh tích điển hình E. ictaluri gây bệnh trên cá rô phi và cá nheo của bệnh do vi khuẩn E. ictaluri như xuất hiện Mỹ nuôi lồng trên các hệ thống sông và hồ chứa nhiều đốm hoại tử trên các cơ quan gan, thận, ở một số tỉnh miền Bắc. Các chủng vi khuẩn sau lách. Dùng que cấy vô trùng thu mẫu vi khuẩn đó được xác định mức độ độc lực trên động vật từ tiền thận cá bị bệnh và nuôi cấy trên môi cảm nhiễm và được gây nhiễm chéo để so sánh trường TSA ở nhiệt độ 28C. Các chủng vi và đánh giá khả năng gây bệnh giữa 2 loài cá ký khuẩn phân lập được quan sát hình dạng, màu chủ. Kết quả nghiên cứu nhằm cung cấp thông sắc, kích thước khuẩn lạc và xác định hình thái tin cho việc xây dựng các giải pháp phòng trừ vi khuẩn bằng nhuộm Gram theo hướng dẫn dịch bệnh do E. ictaluri trên 2 đối tượng nuôi của nhà sản xuất kit nhuộm Gram (Merck). Các đang được ưa chuộng và phát triển mạnh tại chủng vi khuẩn sau phân lập được sử dụng để miền Bắc Việt Nam. thử đặc tính sinh hóa bằng kít API 20E theo 606
3. Đoàn Thị Nhinh, Đặng Thị Hóa, Trần Thị Trinh, Lê Việt Dũng, Nguyễn Thị Hương Giang, Kim Văn Vạn, Đặng Thị Lụa, Trương Đình Hoài hướng dẫn của nhà sản xuất (BioMerieux, 2.2.4. Phương pháp cảm nhiễm xác định liều Pháp) và bảo quản trong môi trường TSB bổ gây chết LD50 sung 20% glycerol (v/v) và giữ trong điều kiện Sau khi phân lập và giám định bằng kỹ âm sâu (-80C) theo phương pháp của Trương thuật PCR, 4 chủng vi khuẩn E. ictaluri gây Đình Hoài & cs. (2019) và Trương Đình Hoài & bệnh từ mỗi loài cá với triệu chứng và bệnh tích cs. (2020) để sử dụng cho các nội dung nghiên điển hình được lựa chọn phục vụ thí nghiệm cứu tiếp theo. cảm nhiễm để xác định liều gây chết 50% (LD50) cho từng chủng. Các chủng vi khuẩn được nuôi 2.2.3. Định danh và giám định vi khuẩn cấy vào môi trường Nutrient Broth đạt mật độ Edwardsiella ictaluri 5,0 108 CFU/ml (xác định bằng phương pháp DNA từ vi khuẩn (n = 8; 4 chủng phân lập đếm đĩa kết hợp đo mật độ quang ở bước sóng từ cá nheo Mỹ, 4 chủng phân lập từ cá rô phi) 2 OD600). Dãy nồng độ vi khuẩn có nồng độ từ 10 được tách chiết theo kit InstaGene Matrix ™ đến 108 CFU/ml cho mỗi chủng vi khuẩn được (Bio-Rad). Quy trình chiết tách DNA được thực chuẩn bị để cảm nhiễm cho cá với liều 0,1 ml/cá hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Kỹ (tương ứng với liều 101 đến 107 CFU/cá). thuật PCR dùng để giám định các chủng vi khuẩn sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại Cá nheo Mỹ và cá rô phi được nuôi thích đoạn gene 16S rRNA và gene xác định loài vi nghi 7 ngày trước khi sử dụng cho các thí khuẩn E. ictaluri (Bảng 1). nghiệm, được lấy mẫu kiểm tra để đảm bảo cá khỏe mạnh và không nhiễm bệnh. Với mỗi Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 5,5 chủng vi khuẩn thử nghiệm, sử dụng hệ thống nuclease-free water; 12,5µl 2X Go Taq green bể nuôi loại 100 lít, mỗi bể nuôi chứa 15 cá, được master mix (Promega); 1µl Mồi ngược (10 1 7 pmole); 1µl mồi xuôi (10 pmole) và 5µl khuôn tiêm các nồng độ vi khuẩn từ 10 đến 10 mẫu DNA. Đối chứng dương sử dụng trong phản CFU/cá, và 1 bể đối chứng được tiêm Phosphat ứng PCR là chủng Edwardsiella ictaluri LMG buffer saline (PBS), thí nghiệm được lặp lại 3 7860, đây là chủng đối chứng dương chuẩn quốc lần. Liều gây chết LD50 được tính theo phương tế phân lập từ cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) pháp của Reed & Muench (1938). Môi trường được cung cấp từ Viện Nghiên cứu Nuôi trồng nước nuôi thí nghiệm được duy trì ở nhiệt độ 27 thủy sản II. ± 1C, pH 7,0-7,5 và không tiến hành thay nước Chu trình nhiệt được thực hiện đối với đoạn trong quá trình nuôi cảm nhiễm. Những thay mồi xác định giống Edwardsiella bao gồm: tiền đổi về tập tính của cá, dấu hiệu bệnh lý và số biến tính ở 94°C trong 3 phút; chu kỳ lặp lại 30 lượng cá chết hàng ngày được theo dõi và ghi lần: biến tính ở 94°C trong 30 giây, gắn mồi ở chép. Mẫu mô gan, thận, lách của cá cảm nhiễm 55°C trong 30 giây, tổng hợp kéo dài ở 72°C được nhuộm Gram để kiểm tra sự hiện diện của trong 2 phút; hoàn thành ở 72°C trong 5 phút. vi khuẩn trong cơ thể, tiến hành phân lập và Chu trình nhiệt được thực hiện đối với đoạn mồi giám định lại vi khuẩn từ cá được cảm nhiễm xác định loài Ed –ictaluri có 3 bước bao gồm: bằng kỹ thuật PCR. Thí nghiệm được thực hiện tiền biến tính ở 94°C trong 3 phút; chu kỳ lặp trong 14 ngày sau khi tiêm cảm nhiễm. lại 35 lần: biến tính ở 94°C trong 30 giây, gắn mồi ở 62°C trong 30 giây, tổng hợp kéo dài ở 2.2.5. Gây nhiễm chéo 72°C trong 60 giây; hoàn thành ở 72°C trong 5 Sau khi xác định được giá trị LD50 của các phút (Sakai & cs., 2009). Sản phẩm PCR được chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá rô phi điện di trên gel 1,5% (TBE 1X) với thang DNA và cá nheo Mỹ. Tiến hành lựa chọn chủng có giá chuẩn 100bp (marker). Sử dụng nguồn điện di ở trị LD50 thấp nhất (độc lực cao nhất) để tiến hiệu điện thế 100V cường độ 100mA, thời gian hành cảm nhiễm chéo. Thí nghiệm gây nhiễm chạy điện di trong 30 phút. Sản phẩm PCR nếu chéo được bố trí và thực hiện tương tự như thí dương tính sẽ cho vạch sáng ở vị trí lần lượt là nghiệm xác định liều gây chết LD50 đã trình bày 848 và 470bp. ở phần 2.2.4. Tuy nhiên, điểm khác biệt trong 607
4. So sánh và đánh giá khả năng nhiễm chéo của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo Mỹ trong điều kiện thực nghiệm thí nghiệm này là chủng vi khuẩn có độc lực cao 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN phân lập từ cá rô phi được sử dụng để tiêm chéo 3.1. Kết quả kiểm tra đặc điểm bệnh tích, cho cá nheo Mỹ và ngược lại. Dãy nồng độ vi khuẩn sử dụng để tiêm chéo là từ 101-107 phân lập và giám định Edwardsiella CFU/cá. Môi trường nước của các bể thí nghiệm ictaluri từ cá rô phi và nheo Mỹ được giữ ở nhiệt độ 27±1C, pH 7,0-7,5 và không Cá rô phi và cá nheo Mỹ nhiễm bệnh tiến hành thay nước trong quá trình cảm nhiễm. xuất hiện các triệu chứng và bệnh tích điển Tình trạng sức khỏe, dấu hiệu bệnh lý và số hình do vi khuẩn E. ictaluri gây ra (Hình 1). lượng cá chết hàng ngày được theo dõi và ghi Quan sát lâm sàng và giải phẫu kiểm tra cho chép chi tiết. Các mẫu cá chết sau quá trình thấy, cá nheo Mỹ nhiễm bệnh thường xuất hiện cảm nhiễm được giải phẫu để tổng hợp triệu các đốm mủ tập trung dày ở gan và phân bố rải chứng bệnh tích và phân lập vi khuẩn. Vi khuẩn rác ở thận, trong khi đó với cá rô phi nhiễm sau phân lập lại được thử đặc tính sinh hóa và bệnh, các đốm mủ thường xuất hiện nhiều ở giám định bằng kỹ thuật PCR. Dấu hiệu lâm lách, thận (đặc biệt là thận trước), tần xuất bắt sàng, khả năng gây chết khi gây nhiễm trực tiếp gặp đốm mủ trên gan rất thấp so với trên cá và gây nhiễm chéo được so sánh và đánh giá. nheo Mỹ. Thí nghiệm được thực hiện trong 14 ngày sau Chúng tôi tiến hành phân lập, thử đặc tính khi tiêm cảm nhiễm. sinh hóa và giám định bằng kỹ thuật PCR cho 4 chủng đại diện phân lập từ mỗi loài cá. Kết quả 2.2.6. Xử lý số liệu cho thấy, vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ 2 loài Các giá trị LD50, tỷ lệ sống của cá trong các cá đều phát triển trên môi trường thạch TSA lô thí nghiệm và nồng độ gây nhiễm đều được sau 48h nuôi cấy trong điều kiện 28C, khuẩn biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình cộng và lạc có kích cỡ nhỏ, dạng đầu kim, màu trắng đục độ lệch chuẩn (SD) sử dụng phần mềm có rìa và bề mặt không đồng nhất. Vi khuẩn Microsoft Excel. Gram âm, có dạng hình que (Hình 2). Bảng 1. Các cặp mồi sử dụng để giám định vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá nheo Mỹ và cá rô phi Gen đích Trình tự đoạn mồi (5′→3′) Độ dài gen đích (bp) Nguồn tham khảo Ed genus F: ACAGCCTGGAAGAGTCCTAC 848 Sakai & cs. (2009) R: TTGAGAGTCGCTGCTTAC Ed-ictaluri F: CAGATGAGCGGATTTCACAG 470 R: CGCGCAATTAACATAGAGCC Hình 1. Bệnh tích trên cá nheo Mỹ (A) và cá rô phi (B) nhiễm vi khuẩn E. ictaluri với đốm mủ trắng trên gan, thận ở cá nheo Mỹ và trên lách, thận ở cá rô phi (mũi tên) 608
5. Đoàn Thị Nhinh, Đặng Thị Hóa, Trần Thị Trinh, Lê Việt Dũng, Nguyễn Thị Hương Giang, Kim Văn Vạn, Đặng Thị Lụa, Trương Đình Hoài Hình 2. Vi khuẩn E. ictaluri phát triển trên môi trường TSA, hình thái khuẩn lạc và hình dạng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá nheo Mỹ (A-C) và cá rô phi (D-E) Kết quả kiểm tra các đặc tính sinh hóa của 2019), trong khi các chủng phân lập được từ cá các chủng vi khuẩn phân lập được tổng hợp ở nheo Mỹ trong nghiên cứu có đặc tính sinh hóa bảng 2 cho thấy 04 chủng vi khuẩn gây bệnh hoàn toàn tương đồng với chủng E. ictaluri phân trên cá rô phi phân lập được trong nghiên cứu lập được trên cá tra (Nguyễn Thị Ngọc Huyền & (RPHB-02.20, RPTQ-04.20, RPHD-05.20, Đặng Thị Hoàng Oanh, 2020) và trên cá nheo RPTB-05.20) có kết quả khác biệt đối với 2 phản Mỹ đã phân lập trước đây (Hawke & cs., 1981). ứng sinh hóa (Citrate utilization và Voges- Kết quả giám định bằng kỹ thuật PCR cho proskauer) so với 04 chủng phân lập được trên thấy 4 chủng E. ictaluri phân lập được từ cá cá nheo Mỹ nhiễm bệnh (NMHB-03.20, NMTQ- nheo Mỹ và 4 chủng phân lập được từ cá rô phi 06.20, NMHD-04.20, NMTB-08.20) (Bảng 2). So đều cho kết quả dương tính với cả 2 cặp mồi: cặp sánh và đối chiếu kết quả thử đặc tính sinh hóa mồi giám định giống Edwardsiella (848bp) và thu được trong nghiên cứu hiện tại với nghiên cặp mồi giám định loài E. ictaluri (470bp) sử cứu trước đây cho thấy, các chủng vi khuẩn E. dụng trong nghiên cứu. Do vậy, tất cả các chủng ictaluri phân lập được từ cá rô phi trong nghiên vi khuẩn phân lập được đều được định danh là cứu đều có sự tương đồng ở hầu hết các chỉ tiêu E. ictaluri (Hình 3). sinh hóa với chủng phân lập bởi Dong & cs. (2019). Sự khác biệt chỉ thể hiện ở phản ứng 3.2. Kết quả xác định liều gây chết 50% citrate utilization, trong khi 4/4 chủng vi khuẩn trên cá thí nghiệm của các chủng vi khuẩn phân lập được trong nghiên cứu đều cho kết quả E. ictaluri thử (+), chỉ có 3/4 chủng phân lập bởi Dong & cs. Kết quả gây nhiễm thực nghiệm xác định (2019) cho kết quả (+) và 1/4 chủng cho kết quả liều gây chết 50% của 04 chủng vi khuẩn gây (-). Kết quả (+) với phản ứng citrate của các bệnh trên cá nheo Mỹ và 04 chủng phân lập từ chủng từ cá rô phi trong nghiên cứu cũng tương rô phi được thể hiện ở bảng 3 cho thấy giá trị đồng với đặc tính của chủng E. ictaluri phân lập LD50 của các chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô từ cá điêu hồng ở khu vực Nam Bộ (Nguyễn Thị phi ở mức 2,5-2,9 × 101 CFU/cá, trong khi các Ngọc Huyền & Đặng Thị Hoàng Oanh, 2020; chủng vi khuẩn phân lập từ cá nheo Mỹ có giá 3 Trương Trọng Nghĩa & Đặng Thị Hoàng Oanh, trị LD50 trong khoảng 4,7-5,4 × 10 CFU/cá. 609
6. So sánh và đánh giá khả năng nhiễm chéo của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo Mỹ trong điều kiện thực nghiệm Trong đó chủng E. ictaluri NMHB-03.20 phân xuất hiện ở gan. Bệnh tích đại thể chính biểu lập từ cá nheo Mỹ và chủng vi khuẩn E. ictaluri hiện trên gan là xuất huyết và tụ huyết (Hình RPHB-02.20 phân lập từ cá rô phi có độc lực cao 5). Tất cả các lô cá được cảm nhiễm bệnh bị chết nhất, tương ứng với liều LD50 thấp nhất, lần hoặc còn sống sau 14 ngày thí nghiệm đều được 3 1 lượt là 4,7 × 10 CFU/cá và 2,5 × 10 CFU/cá. giám định đúng tác nhân gây bệnh là E. ictaluri Kết quả kiểm tra triệu chứng bệnh tích trên bằng các phương pháp nhuộm tươi, nuôi cấy và cá thí nghiệm cho thấy cá nheo Mỹ sau khi gây giám định lại bằng kỹ thuật PCR. Như vậy, cá nhiễm xuất hiện các đốm trắng hoại tử tập thí nghiệm sau khi được cảm nhiễm bằng vi trung nhiều ở gan và thận, rất ít xuất hiện đốm khuẩn phân lập từ đúng loài cá ký chủ biểu trắng ở lách (Hình 4). Trong khi đó, cá rô phi hiện các triệu chứng và bệnh tích điển hình sau khi được tiêm cảm nhiễm vi khuẩn tương tự như trên cá nhiễm bệnh tự nhiên thu E. ictaluri có xuất hiện các đốm mủ trắng tập ngoài thực địa (Trương Đình Hoài & cs., 2020; trung chủ yếu ở lách và thận, ít quan sát thấy Dong & cs., 2019). Bảng 2. So sánh đặc tính sinh hóa của các chủng vi khuẩn E. ictaluri gây bệnh cho cá nheo Mỹ và cá rô phi Chủng E. ictaluri trên cá rô phi Chủng E. ictaluri trên cá nheo Mỹ NMHB-03.20 RPHB-02.20 Đặc điểm sinh hóa NMTQ-06.20 Đối chứng RPTQ-04.20 Đối chứng NMHD-04.20 (Dong & cs., 2019) RPHD-05.20 (Hawke & cs., 1981) NMTB-08.20 RPTB-05.20 Nhuộm gram Gram âm Gram âm Gram âm Gram âm Hình thái vi khuẩn Trực khuẩn Trực khuẩn Trực khuẩn Trực khuẩn Oxidase - - - - Catalase + + + + ONPG - - - - Arginine dihydrolase - - - - Lysine decarboxylase + + + + Ornithine decarboxylase - - + + Citrate utilization + D - - H2S production - - - - Urease - - - - TDA - - - - Indole production - - - - Voges-proskauer + + - - Gelatin - - - - Acid production D-glucose + + + + D-mannitol - - - - Inositol - - - - D-sorbitol - - - - L-rhamnose - - - - D-sucrose - - - - D-melibiose - - - - Amygdalin - - - - L-arabinose - - - - Ghi chú: D: dao động (+ hoặc -). 610
7. Đoàn Thị Nhinh, Đặng Thị Hóa, Trần Thị Trinh, Lê Việt Dũng, Nguyễn Thị Hương Giang, Kim Văn Vạn, Đặng Thị Lụa, Trương Đình Hoài Hình 3. Kết quả giám định PCR các chủng E. ictaluri trên cá nheo Mỹ (A-B) và cá rô phi (C-D) sử dụng cặp mồi định danh giống Edwardsiella (848bp) và cặp mồi định danh loài Edwardsiella ictaluri (470bp) Bảng 3. Kết quả xác định liều gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) của các chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập được từ cá bệnh Loài cá phân lập Tên chủng vi khuẩn Loài cá cảm nhiễm Địa điểm thu mẫu Liều gây chết LD50* (CFU/cá) Cá nheo Mỹ E. ictaluri NMHB-03.20 Nheo Mỹ Hòa Bình 4,7 × 103 E. ictaluri NMTQ-06.20 Tuyên Quang 5,4 ×103 E. ictaluri NMHD-04.20 Hải Dương 4,9 ×103 E. ictaluri NMTB-08.20 Thái Bình 5,3 × 103 Cá rô phi E. ictaluri RPHB-02.20 Rô phi Hòa Bình 2,5 × 101 E. ictaluri RPTQ-04.20 Tuyên Quang 2,8 ×101 E. ictaluri RPHD-05.20 Hải Dương 2,7 × 101 E. ictaluri RPTB-05.20 Thái Bình 2,9 ×101 * Ghi chú: Liều gây chết LD50 trung bình của 3 lần thí nghiệm lặp lại. 3.3. Kết quả gây nhiễm chéo và đánh giá và cá nheo Mỹ tại hồ Hòa Bình. Kết quả xác độc lực định độc lực, khả năng gây chết khi gây nhiễm chéo được thể hiện ở hình 6 và hình 7. Dựa vào kết quả đánh giá độc lực các chủng vi khuẩn gây bệnh cho từng loài cá, chủng vi Kết quả gây nhiễm chéo cho thấy vi khuẩn khuẩn có độc lực cao nhất trên cá nheo Mỹ E. ictaluri NMHB-03.20 phân lập từ cá nheo (E. ictaluri NMHB-03.20) và cá rô phi (E. Mỹ không thể hiện độc lực mạnh trên cá rô phi ictaluri RPHB-02.20) được lựa chọn để gây như khi gây nhiễm trực tiếp cho cá nheo Mỹ. nhiễm chéo cho nhau. Đây cũng là 2 chủng vi Liều gây chết LD50 của chủng E. ictaluri khuẩn được phân lập từ các trại nuôi cá rô phi NMHB-03.20 trên cá rô phi là 2,51 × 106 611
8. So sánh và đánh giá khả năng nhiễm chéo của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo Mỹ trong điều kiện thực nghiệm CFU/cá. Ngoài ra, các biểu hiện bệnh tích trên kiểm tra tất cả các lô cá nheo Mỹ được gây cá rô phi khi tiêm cảm nhiễm chủng E. ictaluri nhiễm cũng không xuất hiện bệnh tích điển NMHB-03.20 phân lập từ cá nheo Mỹ không hình, không xuất hiện các đốm trắng hoại tử giống với biểu hiện khi cá rô phi mắc bệnh trên gan và thận như khi được gây nhiễm trực ngoài thực địa, các đốm trắng đặc trưng chỉ tiếp hoặc khi cá nhiễm bệnh tự nhiên ngoài xuất hiện rải rác ở thận, tần xuất bắt gặp ở thực địa (Hình 8C). Kiểm tra mẫu thận từ cá gan cũng rất thấp và hoàn toàn không xuất được gây nhiễm chéo bằng phương pháp nhuộm hiện trong lách (Hình 8A). Tương tự như vậy, tươi đều cho thấy sự có mặt của vi khuẩn E. chủng vi khuẩn E. ictaluri RPHB-02.20 phân ictaluri mật độ cao trên mẫu mô thận (Hình 8B lập từ cá rô phi khi gây nhiễm cho cá nheo Mỹ và 8D). Như vậy, mặc dù tồn tại với mật độ cao 6 có liều gây chết 50% LD50 là 1,99 × 10 CFU/cá, trong cơ thể cá cảm nhiễm nhưng khả năng gây cao hơn rất nhiều so với giá trị LD50 khi gây bệnh của vi khuẩn E. ictaluri trên loài cá được nhiễm cho cá rô phi (2,5 × 101 CFU/cá). Kết quả gây nhiễm chéo đã giảm đi rất đáng kể. Ghi chú: A-C: Các đốm trắng xuất hiện trên gan, thận cá; D: vi khuẩn E. ictaluri nhuộm tươi thận cá. Hình 4. Cá nheo Mỹ gây nhiễm thực nghiệm chủng vi khuẩn E. ictaluri NMHB-03.20 Ghi chú: A-C: Các đốm trắng hoại tử xuất hiện rõ trên lách và thận cá; D: vi khuẩn E. ictaluri nhuộm tươi trên mẫu thận cá. Hình 5. Cá rô phi gây nhiễm thực nghiệm chủng vi khuẩn E. ictaluri RPHB-02.20 612
9. Đoàn Thị Nhinh, Đặng Thị Hóa, Trần Thị Trinh, Lê Việt Dũng, Nguyễn Thị Hương Giang, Kim Văn Vạn, Đặng Thị Lụa, Trương Đình Hoài Hình 6. Kết quả gây nhiễm thực nghiệm chủng E. ictaluri NMHB-03.20 trên cá rô phi Hình 7. Kết quả gây nhiễm thực nghiệm chủng E. ictaluri RPHB-02.20 trên cá nheo Mỹ Ghi chú: Cá rô phi được gây nhiễm chủng vi khuẩn phân lập từ cá nheo Mỹ (A) và sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri trong thận cá rô phi cảm nhiễm (B). Cá nheo Mỹ được gây nhiễm chủng vi khuẩn phân lập từ cá rô phi (C) và sự hiện diện của vi khuẩn E. ictaluri trong thận cá nheo Mỹ được cảm nhiễm (D) Hình 8. Bệnh tích của cá được gây nhiễm chéo chủng vi khuẩn E. ictaluri 613
10. So sánh và đánh giá khả năng nhiễm chéo của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá rô phi và cá nheo Mỹ trong điều kiện thực nghiệm 2 Như vậy, có thể thấy khi gây nhiễm chéo (LD50 = 4,7 × 10 CFU/cá) và gây ra các đốm chủng vi khuẩn E. ictaluri liều cao có thể gây hoại tử trên nội quan loài cá này với dấu hiệu chết cho cá nheo Mỹ và rô phi trong điều kiện bệnh lý tương tự như trên cá bệnh thu thập ở thực nghiệm. Tuy nhiên so với gây nhiễm trực lồng bè nuôi ngoài thực địa ở một số tỉnh miền tiếp, khi được gây nhiễm chéo cho kết quả khác Nam. Kết hợp với kết quả thu mẫu và phân tích biệt về liều gây chết LD50, độc lực và dấu hiệu ở nhiều địa điểm khác nhau ở khu vực phía Bắc lâm sàng của bệnh. Kết hợp các kết quả xác trong nghiên cứu này, có thể thấy rằng chủng định đặc điểm sinh hóa, giám định bằng PCR và E. ictaluri độc lực cao gây bệnh trên cá rô kết quả gây nhiễm chéo có thể kết luận rằng vi phi/điêu hồng có thể đã lây lan và hiện diện tại khuẩn E. ictaluri gây bệnh ở cá nheo Mỹ và rô nhiều vùng nuôi cá rô phi của Việt Nam. Do phi là có sự khác nhau về một số đặc tính sinh vậy, cần có các giải pháp ngăn chặn để hạn chế hóa, khả năng gây bệnh và bệnh tích gây ra dịch bệnh bùng phát và giảm thiểu gây thiệt hại trên từng loài cá. Sự suy giảm độc lực của vi cho nghề nuôi cá rô phi, phục vụ phát triển bền khuẩn E. ictaluri khi được gây nhiễm sang loài vững loài nuôi này. cá ký chủ khác như giữa cá tra và cá điêu hồng hay từ cá nheo Mỹ sang cá rô phi đã được mô tả 4. KẾT LUẬN ở một số nghiên cứu trước đó. Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Nguyễn Thị Ngọc Huyền Chủng Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên & Đặng Thị Hoàng Oanh (2020) trên chủng cá nheo Mỹ và cá rô phi khác nhau về một số E. ictaluri phân lập từ cá điêu hồng bị bệnh gan đặc tính sinh hóa nhưng tương đồng về kết quả thận mủ chỉ có khả năng gây bệnh ở cá điêu phân tích PCR khi sử dụng 2 cặp mồi đặc hiệu hồng mà không gây bệnh ở cá tra. Tương tự như phân tích giống Edwardsiella và loài E. ictaluri vậy, nghiên cứu tại Mỹ của Plumb & Sanchez trên cá nheo Mỹ. (1983) cho thấy chủng vi khuẩn E. ictaluri phân Giá trị LD50 của chủng vi khuẩn phân lập lập từ cá nheo Mỹ không gây chết cho cá rô phi từ cá rô phi và từ cá nheo Mỹ khi tiêm cho đúng xanh khi được cảm nhiễm, trừ khi sử dụng liều loại ký chủ tương ứng ở mức 2,5-2,9 × 101 tiêm rất cao (108 CFU/cá). Kết quả nghiên cứu CFU/cá và 4,7-5,4 × 103 CFU/cá. Khi được gây chúng tôi một lần nữa cung cấp minh chứng nhiễm chéo, mức độ độc lực của các chủng vi chứng minh rằng chủng vi khuẩn E. ictaluri từ khuẩn đều suy giảm lớn với giá trị LD50 khi cảm cá rô phi có sự khác biệt với chủng gây bệnh ở cá nhiễm chủng phân lập cá nheo Mỹ cho rô phi và nheo Mỹ. Nghiên cứu gần đây của Griffin & cs. chủng phân lập từ rô phi cho cá nheo Mỹ tương (2016) cho thấy chủng vi khuẩn E. ictaluri có ứng ở mức 2,51 × 106 CFU/cá và 1,99 × 106 nguồn gốc từ ký chủ khác nhau thì có sự khác CFU/cá. Với nồng độ gây nhiễm cao (107 biệt về hệ gene, đây có thể là lý do chính làm CFU/cá) vẫn gây chết tỷ lệ cao (> 80%) trên loài cho mức độ độc lực suy giảm khi gây nhiễm chéo cá được gây nhiễm chéo. giữa các loài. Do vậy, cần có thêm các nghiên Kết quả nghiên cứu là thông tin cần thiết cứu tiếp theo để giải trình tự toàn bộ hệ gene cho việc xây dựng kế hoạch, quy hoạch phát triển của chủng E. ictaluri phân lập từ cá nheo Mỹ và các mô hình nuôi trên sông, hồ chứa và định rô phi phân lập được trong nghiên cứu này để hướng phòng trị bệnh do vi khuẩn E. ictaluri gây tìm ra điểm khác biệt về hệ gene giữa chúng, ra trên cá nheo Mỹ và cá rô phi nuôi khi hai loài thiết lập được các cặp mồi đặc hiệu phục vụ cá này đang được phát triển nuôi tập trung trên chẩn đoán phân biệt chủng gây bệnh ở hai loài cùng một hệ thống mở như hiện nay. cá này. Về mức độ lưu hành, theo kết quả của LỜI CẢM ƠN Nguyễn Trọng Nghĩa & Đặng Thị Hoàng Oanh (2019) khi cảm nhiễm chủng E. ictaluri phân Nghiên cứu được thực hiện dưới sự tài trợ lập từ cá điêu hồng có độc lực khá cao của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn 614
11. Đoàn Thị Nhinh, Đặng Thị Hóa, Trần Thị Trinh, Lê Việt Dũng, Nguyễn Thị Hương Giang, Kim Văn Vạn, Đặng Thị Lụa, Trương Đình Hoài trong khuôn khổ dự án Worldbank với mã số đề KHCN trong nuôi cá rô phi quy mô hàng hóa, Hòa tài ĐTKHCN.WB.11/20. Tác giả xin chân Bình, ngày 05/04/2019. thành cảm ơn sự hỗ trợ của các hộ nuôi cá nheo Nguyễn Thị Ngọc Huyền & Đặng Thị Hoàng Oanh (2020). Đặc điểm bệnh học của vi khuẩn Mỹ và cá rô phi tại các tỉnh đã phối hợp thực Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá hiện, tạo điều kiện thu mẫu để hoàn thành tra (Pangasianodon hypophthalmus) và cá điêu nghiên cứu này. hồng (Oreochromis sp.). Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ. 56(1): 947-969 Nguyễn Trọng Nghĩa & Đặng Thị Hoàng Oanh (2019). TÀI LIỆU THAM KHẢO Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella Dong H.T., Senapin S., Jeamkunakorn C., Nguyen ictaluri trên cá điêu hồng (Oreochromis sp.). V.V., Nguyen N.T., Rodkhum C., Khunrae P. & Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ. Rattanarojpong T. (2019). Natural occurrence of 55: 123-131 edwardsiellosis caused by Edwardsiella ictaluri in Plumb J.A. & Sanchez D.J. (1983). Susceptibility of farmed hybrid red tilapia (Oreochromis sp.) in five species of fish to Edwardsiella ictaluri. J. Fish Southeast Asia. Aquaculture. 499: 17-23. Dis. 6: 261-266. Griffin M., Reichley S., Greenway T., Quiniou S., Reed L.J. & Muench H. (1938) A simple method of Ware C., Gao D., Gaunt P., Yanong R., Pouder D. estimating fifty per cent endpoints. American & Hawke J. (2016). Comparison of Edwardsiella journal of epidemiology. 27: 493-497 ictaluri isolates from different hosts and Sakai T., Yuasa K., Sano M. & Iida T. (2009). geographic origins. Journal of Fish Diseases. Identification of Edwardsiella ictaluri and E. tarda 39(8): 947-969. by species-specific polymerase chain reaction Hawke J.P., Mcwhorter A.C., Steigerwalt A.G. & targeted to the upstream region of the fimbrial Brenner D.J. (1981). Edwardsiella ictaluri sp. gene. J. Aquat. Anim. Health. 21: 124-132. nov., the causative agent of enteric septicemia of Soto E., Griffin M., Arauz M., Riofrio A., Martinez A., catfish. International Journal of Systematic and & Cabrejos M.E. (2012). Edwardsiella ictaluri as Evolutionary Microbiology. 31(4): 396-400. the causative agent of mortality in cultured Nile Hoai T.D., Trang T.T., Van Tuyen N., Giang N.T.H. & tilapia. Journal of Aquatic Animal Health. Van Van K. (2019). Aeromonas veronii caused 24(2): 81-90. disease and mortality in channel catfish in Trương Đình Hoài, Kim Văn Vạn, Đào Lê Anh, Vietnam. Aquaculture. 513: 734425. Nguyễn Thị Huyên, Nguyễn Văn Tuyến, Vũ Đức Kim Văn Vạn (2017). Xây dựng mô hình nuôi cá nheo Mạnh, Nguyễn Thị Hương Giang, Trương Quang mỹ (Ictalurus punctatus) trong ao tại Hưng Yên. Lâm & Nguyễn Thị Lan (2020). Đặc điểm bệnh lý Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. và ứng dụng phương pháp PCR chẩn đoán bệnh 15(6): 738-745. gan thận mủ trên cá nheo Mỹ (Ictalurus MARD (2019). Quy hoạch phát triển nuôi cá rô phi đến punctatus). Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt năm 2020, định hướng 2030. Diễn đàn ứng dụng Nam. 18(2): 94-104. 615