Xác định một số tính chất có lợi của các chủng vi khuẩn Lactic phân lập được từ mắm ruốc Huế

Nội dung text: Xác định một số tính chất có lợi của các chủng vi khuẩn Lactic phân lập được từ mắm ruốc Huế

1. HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol. 3(3) – 2019:1458-1467 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT CÓ LỢI CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTIC PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ MẮM RUỐC HUẾ Đỗ Thị Bích Thủy*, Nguyễn Thị Diễm Hương, Đinh Thị Thu Thanh * Tác giả liên hệ: TÓM TẮT Đỗ Thị Bích Thủy Nghiên cứu nhằm xác định khả năng chịu muối của mười chủng Email: vi khuẩn lactic được ký hiệu lần lượt là (R1, R2, R5, R6, R8, R11, dothibichthuy@huaf.edu.vn R12, R14, R15 và R18) thuộc loài Lactobacillus fermentum được phân lập từ mắm ruốc Huế. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng tất Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế cả các chủng khảo sát đều có thể phát triển trong các nồng độ muối từ 5% đến 25% trong thời gian nuôi cấy là 48 giờ. Trong đó, chủng Nhận bài: 05/03/2019 R5 có khả năng chịu muối cao nhất, OD600nm đo được sau khi nuôi Chấp nhận bài: 02/05/2019 cấy chủng R5 trong 48 giờ với nồng độ muối 25% là 0,1864. Vì vậy, chủng này được chọn đẻ xác định khả năng chịu axit, khả năng kết dính và khả năng kháng khuẩn. Số tế bào sống sót của chủng R5 sau ba giờ ủ ở pH 2 là 8,0043 logCFU/ml. Khả năng tự kết dính và đồng kết dính của chủng R5 lần lượt là 23,17% và 24,85%. Khả năng kháng khuẩn của chủng vi khuẩn R5 với chỉ thị Salmonella và E. coli tương đối cao với đường kính vòng kháng khuẩn dao động trong khoảng 11-12 mm. Bên cạnh đó, chúng tôi còn tiến hành xác định hàm lượng nitơ formol và lượng NH3 trong nước mắm truyền thống khi bổ sung một lượng tế bào vi khuẩn lactic. Kết quả Từ khóa: Lactobacillus cho thấy sau một khoảng thời gian khảo sát nhất định, nước mắm fermentum, Khả năng chịu muối, đã được bổ sung một lượng tế bào vi khuẩn lactic Lactobacillus Probiotic, Mắm ruốc Huế, Vi fermentum R5 có hàm lượng nitơ formol tăng lên và hàm lượng khuẩn lactic NH3 giảm xuống. 1. MỞ ĐẦU chịu 25% muối, Halobacillus thailandensis Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram sp. nov., được phân lập từ sản phẩm nước dương, catalase âm tính, sống trong điều kiện mắm Thái Lan. Ngoài khả năng chịu nồng từ vi hiếu khí đến kị khí nghiêm ngặt, không có độ muối cao, chủng này còn có khả năng khả năng tạo bào tử, tạo axit lactic là sản phẩm sinh tổng hợp 3 loại protease ngoại bào nên cuối cùng của quá trình lên men được kết luận là có thể sử dụng để hoàn carbonhydrate. Vì vậy,vi khuẩn lactic có vai thiện sự lên men trong sản xuất nước mắm trò quan trọng trong đời sống của chúng ta. và mắm cá (Chaiyanani và cs., 1999). Chúng là loại vi khuẩn có lợi, có khả năng Tetragenococcus muriaticus được phân lập bảo quản, chế biến và làm tăng giá trị dinh từ mắm cá (sau 6 tháng lên men) có khả dưỡng cho một số thực phẩm. Nhiều nghiên năng chịu muối lên đến 30-32% (Kobayashi cứu đã được thực hiện và công bố về nhiều và cs., 2000). Các chủng vi khuẩn này có công dụng khác của vi khuẩn lactic. Các mặt trong nước mắm và các loại mắmcó tác chủng vi khuẩn lactic có khả năng chịu dụng tạo hương trong quá trình chuyển hóa muối đã được công bố trong sản phẩm nước lên men làm tăng chất lượng của sản phẩm. mắm, các loại mắm. Chủng vi khuẩn lactic Các hợp chất mùi chính do chúng tạo thành là 1458 Đỗ Thị Bích Thủy và Nguyễn Thị Diễm Hương
2. TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 3(3) – 2019:1458-1467 1-propanol, 2-methylpropanal and lactic còn góp phần tạo hương vị đặc trưng benzaldehyde (Udomsil và cs., 2010). Bên của nước mắm nhờ quá trình lên men. cạnh khả năng chịu muối ở nồng độ cao, hệ Với mục đích cung cấp một phần vi khuẩn lactic còn có nhiều tính chất có lợi thông tin về sự đa dạng, tính chất của hệ vi cho sức khỏe, chức năng probiotic. Chủng khuẩn lactic có trong mắm ruốc Huế (sản vi sinh vật có tính chất probiotic trước hết phẩm được lên men từ các nguyên liệu thủy phải sống sót qua được điều kiện khắc nghiệt sản với nồng độ muối 10-12%); chúng tôi của dạ dày. pH của dạ dày người thường dao đã thực hiện đề tài "Khảo sát một số tính động trong khoảng 1 đến 4. Một số nghiên chất có lợi của các chủng vi khuẩn lactic cứu khảo sát khả năng sống sót của chủng phân lập từ mắm ruốc Huế”. nghiên cứu ở các khoảng pH từ 1 đến 3 hoặc 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4 (Liong và Shah, 2005; Maragkoudakis và NGHIÊN CỨU cs., 2006). Một số nghiên cứu khác chỉ khảo sát ở pH đại diện của dạ dày (pH = 2 - 2,5) 2.1. Vật liệu (Maria, 2006; Sangtiago và cs., 2008). Hệ vi Mười chủng vi khuẩn lactic được ký khuẩn lactic có thể cạnh tranh không gian hiệu lần lượt là (R1, R2, R5, R6, R8, R11, với vi khuẩn gây bệnh bằng cách cản chúng R12, R14, R15 và R18) thuộc loài bám dính vào thành ruột nên vi khuẩn lactic Lactobacillus fermentum phân lập từ mắm có thể làm giảm nguy cơ tiêu chảy (Kos và ruốc Huế đã được định danh bằng các cs., 2003; Rahman và cs., 2008). Ba chỉ tiêu phương pháp MALDI-TOF MS và giải quan trọng trong việc đánh giá khả năng trình tự gen PheS tại phòng thí nghiệm vi bám dính của vi khuẩn probiotic có liên sinh, Đại học Ghent, Bỉ. quan đến tác động của chúng với vật chủ, 2.2. Phương pháp nghiên cứu đó là khả năng tự kết dính, đồng kết dính và 2.2.1. Khảo sát khả năng chịu muối bám dính với đường ruột của vật chủ. Đã có Khả năng chịu mặn của các chủng vi nhiều công bố có liên quan đến khả năng khuẩn lactic được đánh giá qua giá trị bám dính của LAB (Kos và cs., 2003; OD600nm (mật độ quang – optical density) Greene và cs., 1994). Khả năng sinh tổng khi nuôi chúng trong môi trường MRS lỏng hợp bacteriocin của vi khuẩn lactic làm cho có chứa các nồng độ muối tương ứng là 0%, chúng ức chế các vi khuẩn gây bệnh đường 5%, 10%, 15%, 20% và 25% sau 24 giờ và ruột (Rhys và cs., 2008). Các nghiên cứu về 48 giờ theo phương pháp của Kobayashi probiotic trên vi khuẩn lactic ở Việt Nam (2004). Phân tích kết quả dựa trên sự so tập trung khảo sát khả năng bám dính, khả sánh giá trị OD ở các nồng độ muối để đưa năng sinh bacteriocin, khả năng chịu muối ra kết luận khả năng tồn tại và phát triển của mật và axit (Nguyễn Thị Hoài Hà và cs., các chủng ở các nồng độ muối khác nhau. 2002; Nguyễn Vũ Tường Vy và cs., 2007). 2.2.2. Khảo sát khả năng chịu axit Mắm ruốc Huế là một loại nước Khả năng chịu axit của chủng khảo chấm đặc trưng được chế biến từ con khuyết sát được đánh giá qua lượng vi khuẩn sống và muối với quy trình lên men phức tạp do sót sau khi ủ ở pH 2 trong 3 giờ. Số tế bào tác dụng của hệ vi sinh vật trong nguyên vi khuẩn sống sót được xác định theo liệu. Trong sản xuất nước mắm, vi khuẩn phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch lactic đóng vai trò vô cùng quan trọng. (Lee và cs., 2011) Không chỉ tham gia vào quá trình thủy phân protein để tạo thành axit amin, vi khuẩn 1459
3. HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol. 3(3) – 2019:1458-1467 2.2.3. Khảo sát khả năng bám dính cấy ở 37 °C trong 48 giờ. Sau thời gian nuôi 2.2.3.1. Khảo sát khả năng tự kết dính (Kos cấy, ghi nhận sự tạo thành vòng vô khuẩn và cs., 2003) xuất hiện xung quanh giếng thạch. Sinh khối tế bào của vi khuẩn thu 2.2.5. Định lượng nitơ formol bằng phương được sau khi nuôi cấy được rửa 2 lần bằng pháp Sorensen đệm PBS (8 g NaCl; 0,2 g KCl; 1,44 g Định lượng nitơ formol có trong mẫu Na2HPO4; 0,24 g KH2PO4; nước cất đủ 1 nước mắm sau khi đã pha loãng đến nồng lít); pH 7,2 vô trùng; sau đó được tái huyền độ thích hợp rồi xác định gián tiếp lượng phù trong đệm PBS (OD600nm =1) (OD ban amin (Hà Duyên Tư, 2009). Tiến hành nuôi đầu). Để yên huyền phù này ở 37 °C trong cấy chủng vi khuẩn trong 24 giờ ở nhiệt độ 5 giờ để tạo điều kiện cho các vi khuẩn phòng trong tủ ấm, sau đó ly tâm thu sinh lactic tự kết dính và lắng xuống và đo OD khối ở 5000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt dịch trên bề mặt. Khả năng tự kết dính là độ 4oC, rửa sinh khối bằng đệm phosphate phần trăm độ giảm OD600nm dịch bề mặt của 0,1M pH 7,2. Tái huyền phù trong đệm PBS mẫu đã để yên 5 giờ so với ban đầu. sao cho OD600nm ~ 1. Phân phối huyền phù 8 2.2.3.2. Khảo sát khả năng đồng kết dính vào nước mắm với mật độ là 10 CFU/ml o với Escherichia coli (E. coli) (Vlková và cs., nước mắm và bảo quản ở tủ ấm 37 C. Tiến 2008) hành phân tích hàm lượng nitơ formol theo các mốc thời gian là 3, 6 và 9 ngày. Kết quả Sau khi rửa 2 lần bằng đệm PBS, sinh được tính theo công thức: khối tế bào của chủng vi khuẩn lactic và E. coli được tái huyền phù ế đ n OD600nm = 1. Số gram nitơ acid amin có trong 1 lít Đồng thời trộn lẫn hai huyền phù này với nước mắm: nhau với thể tích bằng nhau. Tiến hành đo ( − ) × × 0,0007 × 100 × 1000 = OD600nm dung dịch trên bề mặt sau khi để 20 × yên huyền phù của mỗi chủng và hỗn hợp Trong đó: huyền phù của hai chủng ở 37 °C trong 5 - x: lượng gram nitơ acid amin có giờ. Khả năng đồng kết dính được tính theo trong 1 lít nước mắm công thức: - a: số ml dung dịch NaOH 0,05N Tỷ lệ đồng kết dính (%) dùng để chuẩn dung dịch thí nghiệm + 푌 − = 2 ( +푌) × 100 - b: số ml dung dịch NaOH 0,05N + 푌 2 dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng trong đó AX là OD600nm sau 5 giờ của vi - T: hệ số hiệu chỉnh nồng độ của khuẩn lactic; AY là OD600nm sau 5 giờ của E. dung dịch NaOH đem dùng so ớv i nồng độ coli; và AX+Y là OD600nm sau 5 giờ của vi chuẩn. khuẩn lactic và E.coli. - V: số ml nước mắm cho vào bình 2.2.4. Khảo sát khả năng kháng khuẩn định mức Sử dụng phương pháp khuếch tán - 0,0007: số gram nitơ với 1ml giếng thạch để khảo sát khả năng kháng NaOH 0,05N khuẩn của vi khuẩn lactic theo mô tả của 2.2.6. Xác định hàm lượng NH3 trong nước Mishra và Prasad (2005). Theo đó, dịch nổi mắm bằng phương pháp Kjeldahl thu được bằng cách ly tâm (14.000 Phân tích hàm lượng NH trong nước vòng/phút, 10 phút ở 4 °C) canh trường đã 3 mắm đối chứng và nước mắm có bổ sung nuôi cấy ở 37 °C trong 24 giờ, được cho vào chủng vi khuẩn lactic bằng hệ thống chưng các giếng thạch đã tạo trên môi trường MRS cất đạm (Hà Duyên Tư, 2009). Chủng được agar chứa chủng kiểm định (E. coli, nuôi cấy trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Salmonella). Đĩa thạch sau đó được nuôi trong tủ ấm, sau đó ly tâm thu sinh khối ở 1460 Đỗ Thị Bích Thủy và Nguyễn Thị Diễm Hương
4. TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 3(3) – 2019:1458-1467 5000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ 4oC, 2.2.7. Phương pháp toán học xử lý số liệu rửa sinh khối bằng đệm phosphate 0,1M pH Số liệu được tổng hợp và xử lý bằng 7,2. Tái huyền phù trong đệm PBS sao cho chương trình Microsoft Excel 2010. Kết quả OD600nm~ 1. Phân phối huyền phù vao nước thí nghiệm được phân tích bằng chương 8 mắm với mật độ là 10 CFU/ml nước mắm trình One Way ANOVA và kiểm định o và bảo quản ở tủ ấm 37 C. Tiến hành phân Tukey trên phần mềm SPSS 18.0 để so sánh tích hàm lượng NH3 theo các mốc thời gian các giá trị trung bình có sự sai khác có ý là 3 ngày, 6 ngày, 9 ngày. Kết quả được tính nghĩa về mặt thống kê. theo công thức sau: 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN V 1,42 3.1. Khả năng chịu muối của hệ vi khuẩn Hàm lượng NH (mg/ml) = 3 p lactic phân lập từ mắm ruốc Huế Trong đó: Khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ mắm ruốc Huế V: số ml H2SO4 0,1N chuẩn độ được đánh giá qua giá trị OD600nm sau khi 1,42: số mg N ứng với 1ml H2SO4 0,1N nuôi cấy chúng trong môi trường MRS lỏng p: lượng mẫu phân tích tính bằng ml có chứa các nồng độ muối tương ứng là 0%, 5%, 10%, 15%, 20% và 25% sau 48 giờ. Kết quả thu được trình bày ở Bảng 1. Bảng 1. Khả năng chịu muối của hệ vi khuẩn lactic phân lập từ mắm ruốc Huế sau 48 giờ nuôi cấy Tên chủng 0% 5% 10% 15% 20% 25% R1 0,3376b 0,7636a 0,1162d 0,1111e 0,1252c 0,0822f R2 0,3582b 0,8484a 0,2322c 0,1662d 0,1347f 0,1462e R5 0,2565c 0,8632a 0,4125b 0,2196d 0,1179f 0,1821e R6 0,1978c 0,8280a 0,3100b 0,1583d 0,1492e 0,1233f R8 0,2499b 0,8060a 0,1665c 0,1022e 0,1101d 0,0638f R11 0,2943b 0,8012a 0,0833e 0,0943d 0,1135c 0,0604f R12 0,3173b 0,6867a 0,1492c 0,1272e 0,1335d 0,0751f R14 0,3157d 0,8334a 0,4390b 0,3521c 0,1594e 0,1474f R15 0,2477b 0,8008a 0,1919d 0,2292c 0,1534e 0,1413f R18 0,3012b 0,8216a 0,1625c 0,1389e 0,1470d 0,0679f Số liệu xử lý Ducan’s theo dòng (chữ cái in thường) thể hiện sự sai khác theo nồng độ muối của từng chủng. Các chữ cái khác nhau thể hiện sự sai khác về ý nghĩa thống kê (P< 0,05). Qua Bảng 1, chúng tôi nhận thấy tất với các nồng độ khảo sát ở trên. Đặc biệt cả các chủng vi khuẩn lactic phân lập được chủng lactic R5 khả năng sống sót vẫn còn từ mắm ruốc Huế đều có khả năng thích cao ở nồng độ 20% và 25% với giá trị OD nghi và phát triển ở tất cả các nồng độ muối lần lượt là 0,1179 và 0,1821. từ 5% - 25%. Giá trị OD600nm của các chủng Tất cả các chủng vi khuẩn lactic phân vi khuẩn lactic biến thiên qua các nồng độ lập từ mắm ruốc Huế có khả năng thích nghi muối là khác nhau. Trong đó, các chủng vi và phát triển ở các nồng độ muối 5-25%, khuẩn lactic có khả năng thích nghi và phát đều này hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu triển mạnh nhất tại nồng độ muối 5% với giá của Udomsil và cs. (2010) đối với loài trị OD của chủng R5 đạt 0,8632 là cao nhất Tetragenococcus halophilus. Các tác giả đã và chủng R12 đạt 0,6867 là thấp nhất sau ở tiến hành khảo sát khả năng chịu muối của T. 48 giờ nuôi cấy. Khả năng phát triển của các halophilus tại nồng độ 25% trong các mẫu chủng vi khuẩn lactic tại nồng độ muối 15% nước mắm và cho thấy, chúng vẫn sống sót giảm so với nồng độ 10%. Ở nồng độ muối sau bảy tháng trong nước mắm. Juste và cs. 20% và 25% vẫn có khả năng sống sót tuy (2008) đã công bố rằng T. halophilus có khả nhiên sự thích nghi và phát triển của các năng phát triển tại nồng độ muối là 25% và chủng vi khuẩn lactic có xu hướng giảm so 28,5% ở pH7. 1461
5. HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol. 3(3) – 2019:1458-1467 Điều này đã chứng tỏ rằng, khả năng 3.2. Khả năng chịu axit của Lactobacillus chịu muối của các chủng vi khuẩn lactic được fermentum R5 phân lập từ mắm ruốc phân lập từ mắm ruốc Huế là cao, trong đó Huế chủng R5 có khả năng thích nghi và phát Khả năng chịu axit của chủng triển tốt nhất. Chính vì vậy, chủng vi khuẩn Lactobacillus fermentum R5 được khảo sát lactic R5 phân lập từ mắm ruốc Huế có tiềm bằng cách xác định số tế bào sống qua các năng ứng dụng lớn trong việc sản xuất các sản mốc thời gian liên tục từ 0 đến 3 giờ trong phẩm lên men chứa nồng độ muối cao như môi trường pH 2 (Bảng 2). nước mắm, các sản phẩm mắm cá. Bảng 2. Khả năng sống sót của các chủng Lactobacillus fermentum R5 trong điều kiện pH 2 Số tế bào sống còn lại theo thời gian (log CFU/ml) 0 giờ 1 giờ 2 giờ 3 giờ 9,779 9,685 8,066 7,960 Kết quả trên cho thấy khả năng chịu Chủng Lactobacillus fermentum R5 phân axit của chủng Lactobacillus fermentum lập từ mắm ruốc Huế có khả năng chịu axit R5 là cao. Số tế bào sống sót ở 0 giờ là tốt đáp ứng được tiêu chí chịu axit của các 9,779 logCFU/ml, nhưng sau 3 giờ thì khả chủng probiotic. năng sống sót của chủng vi khuẩn 3.3. Khả năng kết dính của Lactobacillus Lactobacillus fermentum R5 có xu hướng fermentum R5 phân lâp từ mắm ruốc giảm so với lúc ban đầu (đạt 7,96 Huế logCFU/ml). Kết quả nghiên cứu về khả Khảo sát khả năng kết dính của vi năng chịu axit phù hợp với nghiên cứu của khuẩn lactic là nghiên cứu có ý nghĩa thực Maragkoudakis và cs. (2006) khi khảo sát tiễn. Đây là đặc tính mang lại nhiều lợi ích khả năng chịu axit của một số chủng cho vi khuẩn lactic trong quá trình sinh Lactobacillus cho thấy các chủng có khả trưởng và phát triển. Chính vì vậy, chúng năng chịu axit mạnh nhất là Lb. paracasei tôi đã tiến hành khảo sát khả năng tự kết subsp. paracasei ACA-DC 130, Lb. dính và đồng kết dính với E. coli của chủng plantarum ACA-DC 146, Lb. rhamnosus nghiên cứu Lactobacillus fermentum R5. ACA-DC 112, với mức giảm log CFU/mL Kết quả được thể hiện ở Hình 1. từ 8,6 xuống còn lần lượt là 6,8; 5,7 và 7,1 sau 3 giờ ủ ở pH 2. % 25.0 24,852 24.5 24.0 23.5 23,172 23.0 22.5 22.0 Tự kết dính Đồng kết dính Hình 1. Khả năng tự kết dính và đồng kết dính của chủng Lactobacillus fermentum R5 1462 Đỗ Thị Bích Thủy và Nguyễn Thị Diễm Hương
6. TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 3(3) – 2019:1458-1467 Kết quả ở hình 1 cho thấy khả năng chủng Lactobacillus fermentum R5 phân bám dính của chủng Lactobacillus lập từ mắm ruốc Huế phù hợp với kết quả fermentum R5 ở các điều kiện khác nhau là công bố của các nhà khoa học trên. hoàn toàn khác nhau. Trong đó, khả năng tự Khả năng đồng kết dính của vi khuẩn kết dính của chủng Lactobacillus lactic với vi sinh vật gây bệnh làm tăng khả fermentum R5 với tỷ lệ phần trăm kết dính năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây đạt 23,172%. Chủng này cũng thể hiện khả bệnh, góp phần cân bằng hệ vi sinh đường năng đồng kết dính với E.coli nhưng có tỷ ruột. Collado và cs. (2007) đã khảo sát khả lệ cao hơn với giá trị đạt được là 24,852%. năng đồng kết dính của các chủng vi khuẩn Nhờ có khả năng tự kết dính mà các lactic và cho thấy sau 4 giờ, tỷ lệ đồng kết vi khuẩn lactic cùng một dòng liên kết được dính trong khoảng 6% đến 27%. Kos và cs. với nhau tạo thành các “tổ”, vì thế chúng (2003) đã nghiên cứu khả năng đồng kết giúp tăng cường được sức sống và sự phát dính của Lb. acidophilus M92 (chủng này triển của chủng theo kiểu mối quan hệ hỗ đang được sử dụng sản xuất chế phẩm trợ cùng loài. Khả năng tự kết dính còn có probiotic) với Enterococcus faecium L3, sự liên quan đến khả năng bám dính đường Escherichia coli 3014, Salmonella công bố ruột và còn làm tăng khả năng lưu lại trong kết quả từ 15,11% đến 19,46%. Các kết quả đường tiêu hóa của chủng vi sinh vật. Maria này cho thấy rằng khả năng đồng kết dính (2006) khi nghiên cứu về đặc điểm sinh lý với vi khuẩn gây bệnh của chủng của một số chủng Lactobacillus để tuyển Lactobacillus fermentum R5 (24,852%) khá chọn dòng làm probiotic đã đưa ra kết quả cao nên có thể làm điều kiện sử dụng trong về tự kết dính của 11 chủng Lactobacillus probiotic. gồm các loài Lb. casei; Lb. johnsonii; Lb. 3.4. Kết quả khả năng kháng khuẩn của paracasei; Lb. rhamnosus và Lb. Lactobacillus fermentum R5 phân lập từ plantanum với kết quả chủ yếu nằm trong mắm ruốc Huế khoảng từ 20% đến 40%. Một kết quả Kết quả kiểm tra tính kháng khuẩn nghiên cứu khác của chúng tôi đã đưa ra tỷ của chủng Lactobacillus fermentum R5 thể lệ kết dính của chủng Lactobacillus hiện hoạt tính bằng phương pháp khuếch tán fermentum DC1 sau 5 giờ là 24,49% (Đỗ đĩa thạch cho thấy xuất hiện các vòng sáng Thị Bích Thủy và cộng sự; 2012). Qua đó vô khuẩn với đường kính khác nhau (Bảng có thể nhận thấy khả năng tự kết dính của 3 và Hình 2). Bảng 3. Khả năng kháng E. coli và Salmonella của chủng Lactobacillus fermentum R5 Chủng chỉ thị Đường kính vòng kháng khuẩn (mm) E. coli 12 ± 0,05 Salmonella 11 ± 0,03 Qua Bảng 3 có thể thấy chủng và Salmonella. Trong đó đường kính vòng Lactobacillus fermentum R5 có khả năng kháng với E. coli là 12 ± 0,05 mm, đối với kháng khuẩn với hai chủng chỉ thị là E. coli Salmonella có vòng kháng 11 ± 0,03 mm . 1463
7. HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol. 3(3) – 2019:1458-1467 E. coli Salmonella Hình 2. Vòng kháng E. coli và Salmonella của Lactobacillus fermentum R5 Kết quả nghiên cứu về khả năng 0,05 mm đến 6 ± 0,25 mm, đường kính vòng kháng khuẩn phù hợp với nghiên cứu của kháng khuẩn kháng Salmonella typhi dao nhiều tác giả. Wakil và cs. (2012) đã khảo động từ 4 ± 0,2 mm đến 10 ± 0,02 mm. Qua sát khả năng kháng E. coli và Salmonella kết quả nghiên cứu có thể thấy chủng của các chủng thuộc Lactobacillus và cho Lactobacillus fermentum R5 có khả năng thấy L. brevis kháng E. coli với đường kính kháng khuẩn tốt với hai chủng E. coli và vòng kháng khuẩn là 10 ± 0,1 mm, kháng Salmonella. Salmonella spp. là 5 ± 0,1 mm, L. 3.5. Xác định hàm lượng nitơ formol và plantarum kháng Salmonella với kích thước NH3 có trong nước mắm vòng kháng khuẩn là 10 ± 0,1 mm. Nwafor 3.5.1. Xác định hàm lượng nitơ formol có (2014) đã khảo sát khả năng kháng E. coli trong nước mắm và Salmonella typhi của các loài vi khuẩn lactic L. acidophilus, L. lactic, L. bugaricus, Kết quả xác định hàm lượng nitơ L. casei, Leuconotoc sp, S. thermophiles, S. formol trong nước mắm khi ta bổ sung chủng cremoris, S. pyogenes. Đường kính vòng Lactobacillus fermentum R5 vào trong nước kháng khuẩn kháng E. coli dao động từ 3 ± mắm truyền thống được thể hiện ở Hình 3. g/l 10 8,63 8,05 8 6,18 7,35 7,82 6 6,65 ĐC 4 R5 2 0 3 ngày 6 ngày 9 ngày Hình 3. Sự biến đổi của hàm lượng nitơ formol trong nước mắm khi bổ sung chủng Lactobacillus fermentum R5 theo thời gian Qua Hình 3 ta nhận thấy theo thời fermentum R5 cao hơn so với mẫu nước gian hàm lượng nitơ formol của mẫu nước mắm đối chứng. Qua các mốc thời gian 3 mắm có bổ sung chủng Lactobacillus ngày, 6 ngày, 9 ngày thì hàm lượng nitơ 1464 Đỗ Thị Bích Thủy và Nguyễn Thị Diễm Hương
8. TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 3(3) – 2019:1458-1467 formol có xu hướng tăng lên, cụ thể ở sau 3.5.2. Xác định hàm lượng NH3 có trong 3 ngày hàm lượng nitơ formol trong mẫu nước mắm nước mắm có bổ sung chủng Lactobacillus Kết quả xác định hàm lượng NH3 có fermentum R5 là 6,65 g/l và sau 9 ngày thì trong nước mắm khi ta bổ sung chủng hàm lượng nitơ formol là 8,63 g/l. Lactobacillus fermentum R5 vào trong nước mắm truyền thống được thể hiện ở Hình 4. mg/ml 1 0.8 0,77 0,64 0.6 0,68 0,55 ĐC 0,59 0.4 0,50 R5 0.2 0 3 ngày 6 ngày 9 ngày Hình 4. Sự biến đổi của hàm lượng NH3 trong nước mắm khi bổ sung chủng Lactobacillus fermentum R5 theo thời gian Từ kết quả trên Hình 3 ta nhận thấy muối NaCl ở các nồng độ 5% đến 25%. theo thời gian hàm lượng NH3 của mẫu nước Trong đó, chủng được ký hiệu R5 là chủng mắm có bổ sung chủng Lactobacillus có khả năng phát triển tốt nhất ở các nồng fermentum R5 thấp hơn so với mẫu nước độ muối. Vì vậy, chủng này đã được chọn mắm đối chứng. Qua các mốc thời gian 3 để tiến hành khảo sát các chỉ tiêu tiếp theo. ngày, 6 ngày, 9 ngày thì hàm lượng NH3 có - Một số đặc điểm của Lactobacillus xu hướng giảm xuống, cụ thể ở 3 ngày hàm fermentum R5 như sau: Số tế bào sống sót lượng NH3 cuả chủng Lactobacillus của chủng R5 sau ba giờ ủ ở pH 2 là 7,960 fermentum R5 là 0,68 mg/ml và sau 9 ngày log CFU/ml. Khả năng tự kết dính và đồng thì hàm lượng nitơ formol là 0,5 mg/ml. kết dính với E.coli của chủng R5 với tỷ lệ Từ kết quả thể hiện trên Hình 3 và 4, phần trăm kết dính lần lượt đạt 23,172% và chúng tôi tạm thời nhận định rằng khi bổ 24,852%. Chủng R5 có khả năng kháng sung vào nước mắm một lượng tế bào vi khuẩn với hai chủng chỉ thị là E. coli và khuẩn lactic Lactobacillus fermentum R5 Salmonella với đường kính vòng kháng lần thì qua một khoảng thời gian nhất định hàm lượt là 12 ± 0,05 mm và 11 ± 0,03 mm. lượng nitơ formol sẽ tăng lên và hàm lượng - Bổ sung vào nước mắm một lượng NH3 sẽ giảm xuống. Vì vậy, bổ sung chủng tế bào vi khuẩn lactic Lactobacillus Lactobacillus fermentum R5 giúp cải thiện fermentum R5 với mật độ là 108 CFU/ml được chất lượng của nước mắm truyền nước mắm thì qua một khoảng thời gian thống, tăng hàm lượng các chất có lợi và nhất định hàm lượng nitơ formol sẽ tăng lên giảm hàm lượng các chất không tốt ở trong và hàm lượng NH3 sẽ giảm xuống. nước mắm. TÀI LIỆU THAM KHẢO 4. KẾT LUẬN 1. Tài liệu tiếng Việt - Tất cả các chủng vi khuẩn lactic Nguyễn Thị Hoài Hà, Phạm Văn Ty và Nguyễn thuộc loài Lactobacillus fermentum phân Thị Kim Quy. (2002). Nghiên cứu khả năng lập từ mắm ruốc Huế đều có khả năng chịu sinh tổng hợp bacterioxin của loài 1465
9. HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol. 3(3) – 2019:1458-1467 Lactobacillus plantarum L24. Tạp chí Di Lactobacillus acidophilus M92. Journal of truyền học và ứng dụng, Chuyên san Công Applied Microbiology, 94, 981–987. nghệ sinh học, 47–52. Lee, J., Yun, H. S., Cho, K. W., Oh, S., Kim, S. Đỗ Thị Bích Thủy và Nguyễn Thị Diễm Hương. H., Chun, T., Kim, B., & Whang, K.Y. (2012). Xác định và khảo sát một số tính chất (2011). Evaluation of probiotic có lợi của chủng Lactobacillus characteristic so fnewly isolated fermentum DC1 phân lập từ sản phẩm dưa Lactobacillus spp,:Immunemodulation and cải Huế. Tạp chí Khoa học, Đại học Huế , longevity. International Journal of Food 71(2), 175 –185. Microbiology, 148, 80–86. Hà Duyên Tư. (2009). Phân tích hóa học thực Liong, M. T., & Shah, N. P. (2005). Acid and phẩm. Hà Nội: Nhà xuất bản Khoa học Kỹ bile tolerance and cholesterol removal Thuật. ability of Lactobacilli strains. Journal of Nguyễn Vũ Tường Vy, Nguyễn Văn Thanh và Dairy Science, 88, 55 – 66. Trần Thu Hoa. (2007). Khảo sát khả năng Maragkoudakis, P. A., Zoumpopouloua, G., chịu đựng acid, muối mật và kháng sinh của Miarisa, C., Kalantzopoulosa, G., Potb, B., một số vi sinh vật là nguyên liệu sản xuất & Tsakalidou, E. (2006). Probiotic potential probiotic dùng đường uống. Tạp chí Dược of Lactobacillus strains isolated from dairy học, 378, 255–263. products. International Dairy Journal, 16, 2. Tài liệu tiếng nước ngoài 189–199. Chaiyanani, S., Maugel T., Huq, A., Robbi, F. Mishra, V., & Prasad, D. N. (2005). Application T., & Colwell, R. R. (1999). Polyphasic of in vitro methods for selection of Taxonomy of a Novel Halobacillus, Lactobacillus casei strains as potential Halobacillus thailandensis sp. nov. isolated probiotics. International Journal Food from Fish Sauce. Systematic and Applied Microbiol, 103, 109-115. Microbiology, 22, 360–365. Nwafor, O. E. (2014). Isolation and Collado, M. C., Meriluoto, J., Salminen, S. identification of lactic acid bacterial (LAB) (2007). Development of new probiotics by from yoghurt and antibacterial activity strain combinations: Is it possible to improve against some clinical isolates. International the adhesion to Intestinal Mucus?. Journal of Journal of Food Nutrition and Safety, 5(1), Dairy Science, 90, 2710–2716. 31–38. Greene, J. D., & Kalenhammer, T. R. (1994). Rahman, M., Kim, W. S., Kumura, H., & Fctore invilved in adhenrence of Lactobacilli Shimazaki, K. (2008). Autoaggregation and to human Caco-2 cells. Applied Envirnoment surface hydrophobicity of Bifidobacteria. Microbiology, 60, 4487 – 4494. World Journal of Microbiology Biotechnology, 24, 1593–1598. Juste, A., Lievens, B., Frans, I., Marsh, T. L., Klinge berg, M., Michiels, C. W., & Rhys, J. J., Hassan, M. H., Monique, Z., Gale, Willems, K. A. (2008). Geretic and B., & John, R. T. (2008). Isolation of lactic physiological diversity of Tetragnococcus axit bacteria with inhibitory activity against halophilus strains isolated from sugar anh pathogens and spoilage organisms salt rich environment. Microbilogy, 154, associated with fresh meat. Food 2600–2610. Microbiology, 25, 228–234. Kobayashi, K., Wahyuni, M., Hamada-Sato, Sangtiago, R. M., Alberto, M., Marias, J. B., N., Imada, C., & Watanabe, E. (2004). Frangcisco, P. N., & Maria, G. C. (2008). Effect of culture conditions on lactic acid Screening of lactic acid bacteria and production of Tetragenococcus species. Bifidobacteria for potential probiotic use in Journal Appl Microbiol, 96(6), 1215–21. Inberian dry fermented sausages. Meat Science, 80(3), 715 – 721. Kos, B., Suskovic, M. J., Vukovic, S., Simpraga, M., & Frece1, J. (2003). Adhesion and Udomsil, N., Rodtong, S., Tanasupawat, S., & aggregation ability of probiotic strain Yongsawatdigul, J. (2010). Proteinase 1466 Đỗ Thị Bích Thủy và Nguyễn Thị Diễm Hương
10. TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 3(3) – 2019:1458-1467 producing halophilic lactic acid bacteria clostridia. Folia Microbiol (Praha), 53(3), isolated from fish sauce fermentation and 263–269. their ability to produce volatile compounds. Wakil, S. M., & Osamwonyi, U. O. (2012). International Journal of Food Isolation and screening of antimicro-bial Microbiology, 141, 186–194. producing lactic acid bacteria from Vlková, E., Rada, V., Smehilová, M., & Killer, fermenting millet gruel. International J. (2008). Auto-aggregation and co- Research Journal of Microbiology, 3(2), aggregation ability in bifidobacteria and 072 –079. DETERMINATION OF SOME BENEFICIAL PROPERTIES OF LACTIC ACID BACTERIAL STRAINS ISOLATED FROM MAM RUOC HUE Do Thi Bich Thuy*, Nguyen Thị Diem Huong, Dinh Thi Thu Thanh *Corresponding Author: ABSTRACT Do Thi Bich Thuy The study aims to determine the salt tolerance of ten lactic acid Email: strains, denoted as (R1, R2, R5, R6, R8, R11, R12, R14, R15 dothibichthuy@huaf.edu.vn and R18) of Lactobacillus fermentum isolated from mam ruoc Hue. The results of the study showed that all of the strains were University of Agriculture and able to grow the concentration of NaCl from 5% to 25% during Forestry, Hue University 48 hours of incubation. The R5 strain had the highest salt th Received: March 5 , 2019 intolerance. OD600nm measured after incubating the R5 strain Accepted: May 2nd, 2019 for 48 hours containing 25% NaCl was 0.1864. Hence, this strain was selected to study on some properties of probiotic potential, acid intolerance, auto-aggregation and inhibition of bacterial growth. The number of viable cells of the R5 strain after three hours of incubation at pH 2 was 8,0043 logCFU/ml. The ability of autoaggregation was 23,17%, and the coaggregation with E. coli was 24,85%. The clear zone with a diameter of 10–12 mm appeared in the inhibition test against Escherichia coli and Salmonella. In addtion, we preliminarily determined of formol nitrogen contents and NH3 contents in the traditional fish sauce that was added with the number of Keywords: Lactobacillus fermentum, lactic bacterial cells. The results showed that after a certain Lactic acid bacteria, Mam ruoc Hue, period of survey, formol nitrogen contents increased and NH3 Probiotic, Salt intolerance contents reduced in fish sauce. 1467