Bài giảng Đại cương về sắc ký

Nội dung text: Bài giảng Đại cương về sắc ký

1. GENERAL ASPECTS OF CHROMATOGRAPHY 1.1 General concepts of analytical chromatography 1.2 The chromatogram 1.3 Gaussian-shaped elution peaks 1.4 The plate theory 1.5 Nernst partition coefficient ( K ) 1.6 Column efficiency 1.7 Retention parameters 1.8 Separation (or selectivity) factor between two Solutes 1.9 Resolution factor between two peaks 1.10 The rate theory of chromatography 1.11 Optimization of a chromatographic analysis 1.12 Classification of chromatographic techniques
2. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ SẮC KÝ • Sắc ký là một phương pháp tách dựa trên tính chất vật lý hay hóa lý của các cấu tử trong hổn hợp ở thể khí hay lỏng. Tiến trình xãy ra như trong quá trình chưng cất, trích ly gián đoạn. • Tiến trình sắc ký có thể mô tả như sau : + Một pha đứng yên được cấu tạo có thể là một cột rỗng, một tờ giấy, một bản mặt v.v được làm đầy một loại rắn hay lỏng phù hợp gọi là pha tĩnh + Trên một đầu pha tĩnh cho vào một lượng mẫu nhỏ có chứa các thành phần ra khỏi nhau
3. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ SẮC KÝ + Pha động là những dung môi được đưa lên liên tục sau khi cho mẫu vào, pha động sẽ di chuyển trong cột do trọng lực và đem các cấu tử khác nhau trong mẫu theo chúng. Quá trình này gọi là sự rửa giải. Nếu các thành phần này di chuyển với những tốc độ khác nhau thì chúng sẽ tách ra khỏi nhau và có thể thu hồi cùng với pha động.
4. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ SẮC KÝ • Đây là phương pháp được sử dụng đầu tiên vào đầu thế kỷ 20 đo nhà thực vật Michaël Tswett • Quá trình xãy ra trên cột có thể áp dụng để tách và làm sạch trong tiến trình xử lý mẫu (chuẩn bị cột sắc ký) • Quá trình xãy ra đã hình thành kỹ thuật phân tích sắc ký bằng cách đo thời gian di chuyển của các hợp chất khác nhau, nghĩa là có thể định danh chúng mà không cần thu nhận và phân tích. Quá trình định danh một hợp chất cần thiết phải có chất chuẩn của nó.
5. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ SẮC KÝ • Kỹ thuật sắc ký nhanh chóng phát triển, cùng với sự hổ trợ của các ngành khoa học khác như toán học, vật lý, tin học v.v và nó có thể tách ở những thành phần ở mức vi lượng. • Biểu đồ nhận được từ quá trình chạy sắc ký gọi là sắc ký đồ. Sắc đồ ký đồ mô tả trình tự quá trình rửa giải các thành phần khác nhau khi ra hỏi cột • Detector là thiết bị nhận biết các cấu tử khi ra khỏi mẫu, nó cho biết thời điểm các cấu tử ra khỏi cột và cường độ tương tác các cấu tử với detector. Thông tin này giúp cho việc định danh và định lượng các cấu tử trong mẫu ban đầu. • Như quá trình sắc ký xãy ra hai giai đoạn.
6. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ SẮC KÝ Việc định danh một hợp chất chỉ dựa vào thời gian lưu là chưa hợp lý. Thường người ta kết hợp với một vài phương pháp khác như Mass spectrometer hay Infrared Spectrometer. Những thiết bị này sẽ cho những thông tin độc lập từ đó có thể so sánh và kết luận.
7. GAUSSIAN-SHAPED ELUTION PEAKS • Sắc ký đồ rửa giải của một peak có dạng giống với biểu đồ phân bố Gaussian • Trong đó µ tương ứng với thời gian lưu của peak rửa giải, σ là độ lệch chuẩn của peak (σ2 là phương sai). • y là tín hiệu nhận được từ detector nó giống như hàm theo thời gian x • Trong trường hợp lý tưởng hàm phân bố có thể mô tả theo phương trình: Đặt: Suy ra:
8. GAUSSIAN-SHAPED ELUTION PEAKS • Phương trình trên có đồ thị là một đường cong đối xứng ( x=0 khi y= 3.999), đồ thị đi qua hai điểm uốn tại x= +1 và -1, tương ứng với giá trị y đạt được là 0,242 ( chiều cao tương ứng là 60.6% so với giá trị cực đại. Độ rộng của peak tại điểm uốn là 2σ (σ =1). • Trong sắc ký đồ w1/2 là ký hiệu cho độ rộng tại ½ chiều cao peak (w = 2,35σ). Độ rộng của peak tính tại nền và được đo ở chiều cao đạt được là 13,5% so với chiều cao cực đại là w= 4 σ
9. THE PLATE THEORY • Gần một nữa thế kỷ các thuyết lần lượt ra đời để giãi thích sự di chuyển và phân tách của các cấu tử trong cột. • Craig’s theoretical plate model được xem là thuyết giãi thích quá trình di chuyển và phân tách các cấu tử chất tan trong cột là hợp lý nhất. • Mặc dù quá trình xãy ra trong cột là một quá trình xãy ra liên tục nhưng theo mô hình của Craig, ông cho rằng đó là những bước tiếp nối riêng biệt. Trong sắc ký lỏng – rắn các tiến trình cơ bản này là sự tuần hoàn của sự hấp phụ và giãi hấp phụ. Các bước này tái lập lại tuần hoàn theo sự di chuyển của các cấu tử trong cột. • Mỗi bước tương ứng với một trạng thái cân bằng mới gọi là đĩa lý thuyết
10. THE PLATE THEORY • Các đĩa này sắp xếp dọc theo chiều dài cột. Mỗi một chất khi di chuyển trong cột sẽ có số lần tái tổ hợp khác nhau( hấp phụ / giãi hấp phụ) nên số đĩa khác nhau. • Nêu gọi chiều cao tương đương của một đĩa lý thuyết là H (Height equivalent to a theoretical plate) • Ta có :
11. THE PLATE THEORY + Nếu tính lượng chất trên đĩa thứ J tại thời điểm I ta có: Tổng lượng chất tan mT là tổng số lượng chất tan được pha động di chuyển tới từ đĩa thứ (j-1) nằm cân bằng tại thời điểm (i-1) và lượng chất tan thực sự có sẵn ở đĩa thứ j tại thời điển (i-1)
12. THE PLATE THEORY Lý thuyết có một lỗi nghiêm trọng ở chỗ nó không tính đến phân tán trong cột do sự khuếch tán của các hợp chất
13. Nerst partition coefficient(K) • Thông số hóa lý cơ bản của quá trình sắc ký là hằng số cân bằng K, gọi là hệ số phân bố, được tính bằng tỷ số nồng độ của chất tan nằn giữa hai pha • Hệ số K có thể rất lớn, như 1000 nếu như pha động là khí hoặc nhỏ khi pha động là lỏng • Mỗi một hợp chất thường phân bố trong vùng không gian trong cột, và có nồng độ khác nhau ở những vùng khác nhau ( CM và CS khác nhau) nhưng tỷ số của chúng không đổi
14. COLUMN EFFICIENCY • Hiệu quả cột (số đĩa lý thuyết) N: Số cân bằng xãy ra trong cột khi cấu tử đi qua suốt bề mặt cột. • Độ phân tán σ được tính theo phương sai σ2 , giá trị này tăng với khoảng cách phân tán. Khi khoảng cách phân tán tiến đến chiều dài L của cột Ta có :
15. COLUMN EFFICIENCY • Theo trên ta có : • Suy ra: • Hay:
16. SỐ ĐĨA HIỆU QUẢ THỰC TẾ • Để đánh giá đúng thực chất hiệu quả cột đối với sự tách một cấu tử, thông số thời gian lưu tR được thay thế bằng thời gian ’ lưu thực tế t R • Lúc này ta có : Hay • Nếu tính ở độ rộng w1/2:
17. CÁC THÔNG SỐ LƯU GIỮ  Thời gian lưu tR (Retention time)  Thể tích của pha động trong cột (thể tích chết)  Thể tích của pha tĩnh  Hệ số phân bố  Thể tích phân giãi VR  Hệ số dung lượng k' (Capacity factor)
18. THỜI GIAN LƯU (Retention time) tR = tO . (1 + k') • Bản chất của pha tĩnh • Bản chất, thành phần,tốc độ của pha động • Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan • Một số yếu tố khác
19. THỂ TÍCH CỦA PHA ĐỘNG VÀ PHA TĨNH TRONG CỘT VS = VC - VM
20. THỂ TÍCH PHÂN GIÃI VR
21. HỆ SỐ PHÂN BỐ K = Cs /Cm Phụ thuộc vào: . Bản chất các pha . Chất tan . Nhiệt độ
22. HỆ SỐ DUNG LƯỢNG k (Capacity factor) k = mS / mM = K.VS / VM Khối lượng chất tan bị lưu giữ trong pha tỉnh và pha động tỷ lệ với thời gian hay số mol của chúng nên có thể viết: ’ Vì thời gian lưu thực tế t R chính là tS nên có thể viết
23. HỆ SỐ DUNG LƯỢNG k (Capacity. factor) • Từ đây có thể viết:
24. HỆ SỐ DUNG LƯỢNG k (Capacity factor)
25. HỆ SỐ CHỌN LỌC GIỮA HAI CẤU TỬ • Hệ số chọn lọc α cho phép so sánh hai peak liền kề trong một sắc ký đồ, xem chúng thể tách ra khỏi nhau không. • Hệ số chọn lọc α là được đánh giá là tỷ số giữa hệ số dung lượng cột của hai peak Hay
26. HỆ SỐ PHÂN GIÃI GIỮA HAI PEAK • Hệ số phân giãi R giữa hai cấu tử trong cột cho phép đánh giá hai cấu tử này có thể tách ra khỏi nhau không (hệ số α cũng giúp cho chúng ta đánh giá trên mức độ này) • Hệ số R được đánh giá là theo biểu thức sau:
27. HỆ SỐ PHÂN GIÃI GIỮA HAI PEAK • Giá trị đo R phản ảnh mức độ phân giãi giữa hai peak
28. HỆ SỐ PHÂN GIÃI GIỮA HAI PEAK • Ảnh hưởng của chiều dài cột đến độ phân giãi
29. HỆ SỐ PHÂN GIÃI GIỮA HAI PEAK • Phương trình liên hệ giữa độ phân giãi R với hệ số lưu k, hệ số chọn lọc α và hiệu quả cột được biểu thị như sau:
30. PHƯƠNG TRÌNH VAN DEEMTER • Phương trình Van deemter (1956) mô tả sự ảnh hưởng của tốc độ dòng pha động đến hiệu quả tách. • Ba hệ số A,B,C liên quan khác nhau tùy thuộc vào bản chất của cột và điều kiện thực nghiệm. • Trong đó A là hệ số khuyếch tán xoáy, B là hệ số khuyếch tán dọc theo cột, C là hệ số truyền khối. • Nếu H có đơn vị là cm thì A là cm, B là cm2/s, C là s
31. PHƯƠNG TRÌNH VAN DEEMTER + Phương trình cho thấy sự tồn tại của tốc độ dòng pha động mà tại đó hiệu quả cột là lớn nhất. + Hiệu quả cột giảm khi tốc độ dòng pha động tăng. + Hiệu quả cột đạt cao nhất khi H nhỏ nhất ứng với
32. TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ • Mục đích của quá trình tối ưu hóa là có được sự tách hoàn toàn các chất cần phân tích trong thời gian ngắn nhất khi đi qua cột. • Để có được tối ưu quá trình sắc ký người ta phải sử dụng những nguồn sẵn về thiết bị, phần mềm dể mô phỏng được những kết quả thu được từ sự thay đổi các thông số vật lý khác. • Quá trình tối ưu hóa đồng nghĩa với việc chọn lựa: Cột, chiều dài cột, đường kính cột, thành phần pha tĩnh trong cột, tốc độ dòng và thành phần pha động. Tất cả những yếu tố này lại tương tác với nhau. Ví dụ độ phân giãi R và thời gian chu kỳ sắc ký tỷ lệ nghịch với nhau.
33. TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ
34. TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ Năm hệ số K, N, k, α và R ảnh hưởng chủ yếu khi xem xét tối ưu hóa quá trình sắc ký
35. PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ • Sắc ký lỏng (LC) • Sắc ký khí (GC) • Sắc ký dòng siêu chảy (SFC)
36. PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ LC (Liquid chromatography) • Trong LC thành phần pha động là lỏng, là loại sắc ký được biết đến đầu tiên. • Tùy thuộc vào cơ chế lưu giữa chúng mà có những loại sắc ký sau: Sắc ký lỏng- rắn, sắc ký ion, sắc ký rây phân tử, sắc ký lỏng- lỏng, sắc ký lỏng pha liên kết
37. PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ Sắc ký lỏng-rắn : còn gọi là sắc ký hấp phụ. Pha tĩnh trong trường hợp này là chất rắn trơ đối với các chất cần phân tích. Hệ số hóa lý cho quá trình là hệ số hấp phụ. Ngày nay đã có những pha tĩnh được thiết lập đa dạng hơn để đáp ứng hiệu quả tách. Sắc ký trao đổi ion: Trong kỹ thuật này pha động là những dung dịch đệm, còn pha tĩnh là rắn có cấu tạo bề mặt gắn những nhóm trao đổi ion. Quá trình tách theo kiểu này được đặc trưng bởi hệ số phân bố ion
38. PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ Sắc ký rây phân tử ( Size exclusion chromatography): Pha tĩnh trong kỹ thuật này là những vật liệu trên đó có những lổ xốp. Kích thước lổ là yếu tố đặc trưng cho quá trình tách. Các phân tử có kích thước phù hợp với kích thước lổ sẽ được lưu giữ trong cột lâu hơn. Tùy thuộc vào bản chất pha động là dung dịch hay dung môi hửu cơ mà ta có sắc ký lọc gel (gel filtration) và sắc ký thẩm thấu gel (gel permeation). Trong kỹ thuật này hệ số phân bộ được gọi là hệ số phân tán( diffusion coefficient)
39. PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ • Sắc ký lỏng- lỏng: Pha tĩnh là lỏng được phủ lên vật liệu trơ hay xốp (giống như chất mang). Quá trình tách các chất dựa trên sự phân bố chất tan giữa hai hai pha tĩnh và động (đều là pha lỏng), nên hệ số đặc trưng cho quá trình là hệ số phân bố. Kỹ thuật hiện nay ít được dùng vì pha tĩnh dễ bị hòa tan, người ta gọi là hiện tượng chảy máu cột (bleeding)
40. PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ Sắc ký lỏng – pha liên kết • Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography). • Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số nguyên nhân sau: – Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích. – Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi
41. PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ • Sắc ký khí (GC) Pha động trong trường hợp này là các khí mang như N2,H2,He. Tùy vào bản chất của pha tĩnh mà người ta phân loại sắc ký khí làm 2 loại - Sắc ký khí - lỏng ( GLC) - Sắc ký khí- rắn (GSC)
42. PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ Sắc ký khí - lỏng (GLC): - Pha tĩnh là lỏng được phủ lên bề mặt rắn của một chất mang bằng sự hấp thụ bề mặt hay liên kết với bề mặt bên trong chất mang của cột. - Mẫu phải được hóa hơi và được khi mang đưa đi qua cột - Kỹ thuật này được Martin và Synge đưa ra vào 1941 để thay thế pha động là lỏng, điều này dẫn đến làm tăng khả năng tách các hợp chất từ trong mẫu ban đầu. Hệ số phân bố K là đặt trưng cho quá trình tách
43. PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ • Sắc khí khí-rắn (GSC) - Trong sắc khí loại này pha tĩnh ở dạng rắn xốp như than hoạt tính, silicagel, bột nhôm. Pha động là khí. - Sắc ký loại này ảnh hưởng tới những cấu tử trong hổn hợp có nhiệt sôi thấp. Hệ số hấp phụ là đặt trưng cho quá trình
44. PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ • Sắc ký dòng siêu chảy(SFC- supercritical fluid chromatography) - Pha động ở đây ở trạng thái dòng siêu chảy của nó như Cacbondioxyt ở khoảng 500C và 150 atm. - Pha tĩnh lúc này có thể ở cả hai trạng thái lỏng – rắn. - Kỹ thuật này kết hợp với các loại sắc ký lỏng – lỏng hay lỏng khí để tăng hiệu quả tách