Điều chỉnh quy trình semi-nested rt-pcr chẩn đoán tilapia lake virus (tilv) và bước đầu phân lập tilv từ cá rô phi Việt Nam

Nội dung text: Điều chỉnh quy trình semi-nested rt-pcr chẩn đoán tilapia lake virus (tilv) và bước đầu phân lập tilv từ cá rô phi Việt Nam

1. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II ĐIỀU CHỈNH QUY TRÌNH SEMI-NESTED RT-PCR CHẨN ĐOÁN TILAPIA LAKE VIRUS (TiLV) VÀ BƯỚC ĐẦU PHÂN LẬP TiLV TỪ CÁ RÔ PHI VIỆT NAM Ngô Huỳnh Phương Thảo1*, Trần Hạnh Triết1, Nguyễn Hoàng Thụy Vy1, Lê Thị Thu Thảo1, Bùi Nguyễn Chí Hiếu1, Trần Thị Thanh Hương1, Nguyễn Hoàng Chi Mai2, Lê Hoàng Thế Huy3, Trần Nhựt Linh4 TÓM TẮT Tilapia Lake virus là loại virus được phát hiện trên cả cá rô phi trong tự nhiên và cá rô phi nuôi. Đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên về TiLV phân lập tại Việt Nam. Trong năm 2019 và 2020, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thu thập 51 mẫu cá rô phi nghi ngờ nhiễm TiLV tại thành phố Hồ Chí Minh (Tp. HCM) và Vĩnh Long. Kết quả semi-nested RT-PCR cho thấy chỉ có 02/51 (3,9%) mẫu dương tính với virus TiLV, các mẫu còn lại đều cho kết quả âm tính. Việc nuôi cấy virus trên dòng tế bào E-11 được thực hiện thành công trên 02 mẫu virus TiLV Việt Nam (VL160 và VL167). Tuy nhiên, các mẫu virus TiLV Việt Nam chưa được duy trì thành công trên dòng tế bào E-11 qua các lần cấy chuyền và quy trình này cần phải được tối ưu thêm. Ngoài ra, nghiên cứu cũng đã thay đổi quy trình semi-nested RT-PCR chẩn đoán TiLV để đạt hiệu quả khuếch đại tốt hơn, so với 02 quy trình semi-nested RT-PCR cho TiLV phổ biến hiện nay bằng cách thay cặp mồi đặc hiệu bằng cặp mồi Random hexamer/OligodT trong phản ứng tổng hợp cDNA. Mặc dù, độ nhạy của quy trình RT-PCR tối ưu này cần được khảo sát thêm ở các nồng độ mẫu RNA khác nhau, nhưng quy trình RT-PCR này có thể được ứng dụng tại các đơn vị kiểm soát dịch bệnh thủy sản để tăng hiệu quả phát hiện virus TiLV. Từ khóa: Tilapia Lake virus, cá rô phi, phản ứng semi-nested RT-PCR, tế bào E-11 I. GIỚI THIỆU thuộc họ Orthomyxoviridae do sự tương đồng Tilapia Lake virus (TiLV) được tìm thấy lần với các cấu trúc gen ở Orthomyxoviruses. Tuy đầu tiên trên cá rô phi nuôi vào năm 2014 tại Israel nhiên, sau này TiLV được xếp vào một họ mới, (Eyngor et al., 2014a). Đây là loại virus RNA Amnoonviridae, thuộc cùng bộ Articulavirales mạch đơn, sợi âm, có vỏ bọc và chứa 10 đoạn với Orthomyxoviridae (ICTV, 2020). Tỷ lệ chết trình tự mã hóa cho 14 protein (Bacharach et al., trong các ổ dịch tự nhiên từ 09-90%; bệnh xuất 2016; Eyngor et al., 2014a; Surachetpong et al., hiện ở mọi lứa tuổi nhưng chủ yếu tập trung ở cá 2017), với kích thước từ 55 đến 100 nm (Del- giống (01-03 tháng tuổi). Cá rô phi đỏ (cá điêu Pozo et al., 2017; Eyngor et al., 2014a; Ferguson hồng) giống nuôi lồng bị nhiễm bệnh, tỷ lệ chết et al., 2014; Surachetpong et al., 2017; Acharya có thể lên tới 90% trong vòng một tháng sau thả. et al., 2019). Trước đây, TiLV được đề xuất Bệnh lây lan theo chiều ngang từ cá bệnh sang 1 Trung tâm Công nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh 2 Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh 3 Đại học Nguyễn Tất Thành 4 Trường Đại học Quốc tế, Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh * Email: nhpthao.snn@tphcm.gov.vn; tilv.bc2@gmail.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 45
2. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II cá khoe trong cùng ao nuôi, trại nuôi, qua nguồn Thú y đã tổ chức phối hợp các đơn vị liên quan nước, dụng cụ (Cục Thú y, 2017); đồng thời tổ chức điều tra, lấy mẫu xét nghiệm TiLV trên theo chiều dọc từ cá bố mẹ sang cá con thông cá rô phi, tính đến nay đã lấy và xét nghiệm 257 qua trứng và tinh trùng cá (Dong et al., 2020). mẫu cá tại 15 tỉnh, thành phố, trong đó có 60 Vào tháng 5 năm 2017, FAO đã ban hành mẫu (chiếm 26,43%) dương tính với TiLV (Chi hệ thống cảnh báo sớm và thông tin toàn cầu số cục Chăn nuôi, Thú y và Thủy sản tỉnh Bình 338 về TiLV (FAO, 2017) và Tổ chức Thú y Thế Dương, 2017). Do đó, theo nhận định của OIE, giới (World Organization for Animal Health, FAO và Mạng lưới các Trung tâm Nuôi trồng OIE) đã công bố trang thông tin về bệnh TiLV thủy sản khu vực Châu Á Thái Bình Dương (OIE, 2017a). Sau đó, hơn 14 quốc gia/vùng (NACA), Việt Nam là nước thuộc diện có nguy lãnh thổ đã báo cáo với OIE về sự hiện diện của cơ rất cao đối với bệnh này. Để chuẩn bị sẵn TiLV, ví dụ như Đài Loan (OIE, 2017b), Israel sàng đối phó với dịch bệnh nguy hiểm này, Cục (OIE, 2017c), Thái Lan (OIE, 2017d), Malaysia Thú y bước đầu ban hành một số văn bản chỉ (OIE, 2017e), Peru (OIE, 2018) và Philippin đạo nhằm cảnh báo về nguy cơ bùng phát và (OIE, 2017f). Trong khi OIE gọi dịch bệnh lây lan của dịch bệnh do TiLV gây ra trên cá rô do TiLV gây ra là “tilapia lake virus” ((OIE), phi, như công văn 1357/TY-TS ngày 17/7/2017 2017a), một số tên khác cũng được sử dụng về hướng dẫn phòng, chống bệnh do TiLV trên trong các báo cáo khoa học như bệnh viêm gan cá rô phi; công văn số 8862/BNN-TY ngày do virus ở cá rô phi (syncytial hepatitis of tilapia, 20/10/2017 về chỉ đạo áp dụng các biện pháp SHT) (Ferguson et al., 2014) và Hội chứng chết cấp bách phòng, chống dịch bệnh mới do TiLV hàng loạt tháng nuôi đầu (1-month mortality gây ra trên cá rô phi. syndrome) (Tattiyapong et al., 2017). Bệnh này Quy trình semi – nested RT-PCR phát hiện có thể lây lan qua hoạt động vận chuyển cá rô TiLV trên các mẫu cá bệnh đều dựa theo công phi giống mang mầm bệnh từ nước này sang bố của Dong et al. (2017). Quy trình này dựa nước khác. vào đoạn trình tự số 3 trong bộ gen TiLV và hiện Tại Việt Nam, cá rô phi được kỳ vọng là được các đơn vị thuộc Cục thú y Việt Nam ứng đối tượng nuôi và xuất khẩu chủ lực của ngành dụng trong chẩn đoán TiLV (TCCS 05:2017/ thủy sản. Tuy nhiên, việc nuôi thâm canh cá rô TY-TS). Sau đó, Taengphu et al. (2020) phát phi đang gặp phải trở ngại khá lớn đó là dịch triển quy trình tương tự trên đoạn trình tự số bệnh xuất hiện ngày càng nhiều và lây lan trên 1 của chủng TiLV. Cả hai quy trình này đều sử diện rộng, gây thiệt hại đáng kể cho người nuôi. dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen mục tiêu vào Từ năm 2015, Việt Nam có nhập khẩu cá rô phi quá trình tổng hợp cDNA. về làm giống hoặc thực phẩm từ một số nước Chính vì vậy, trong nghiên cứu này, bộ mồi có công bố dịch bệnh do TiLV (Thái Lan, Đài Random hexamer và OligodT được sử dụng vào Loan, Israel, Philippin) hoặc nước nguy cơ cao quá trình tổng hợp cDNA của phản ứng semi- xuất hiện bệnh này (Vương quốc Anh, Trung nested RT-PCR chẩn đoán TiLV và so sánh Quốc). Nguy cơ TiLV xâm nhiễm vào Việt Nam hiệu quả khuếch đại giữa các quy trình với nhau. thông qua đường nhập khẩu cá rô phi giống là Ngoài ra, hiện chưa có nghiên cứu nào nuôi cấy rất cao do bệnh này chưa có trong danh sách các chủng TiLV phân lập từ cá rô phi nuôi tại Việt bệnh phải công bố dịch theo quy định của OIE Nam. Do đó, nghiên cứu này đã tiến hành thu (Jansen et al., 2019) và pháp luật hiện hành của thập và nuôi cấy chủng TiLV Việt Nam trên Việt Nam (Cục Thú y, 2017a). Ngoài ra, Cục dòng tế bào E-11. 46 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
3. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Cặn sau khi rửa được phơi khô ở nhiệt độ phòng NGHIÊN CỨU trong 5-10 phút. Sau đó, cặn được hòa trong 2.1. Nguồn gốc các mẫu virus TiLV đối 10-20 µL nước nuclease-free (Thermo Fisher chứng và tế bào E-11 Scientific) qua đêm ở 4oC. RNA được bảo quản Chủng TiLV-TL Thái Lan và dòng tế bào ở -80oC cho đến khi dùng. Nồng độ và chất E-11 ( lượng RNA sau khi tách được kiểm tra bằng product/sigma/01110916?lang=en®ion=VN máy Nanodrop (Thermo Scientific). ) được cung cấp bởi Khoa Khoa học và Công Ngoài ra, để làm tăng hiệu suất tách chiết nghệ, trường Đại học Suan Sunandha Rajabhat, RNA từ dịch nuôi cấy TiLV, bộ kit QIAmp Viral Thái Lan. RNA Mini (Qiagen) cũng được sử dụng theo Mẫu cá rô phi dương tính với TiLV (TiLV- hướng dẫn của nhà sản xuất. RIA2) được cung cấp bởi Viện Nghiên cứu 2.2.2. RT-PCR chẩn đoán TiLV Nuôi trồng Thủy sản II. Mẫu mô này được phân Quy trình semi-nested RT-PCR khuếch đại lập từ trại cá rô phi ở Tp. HCM và bảo quản đoạn trình tự thứ 3 của TiLV với bộ mồi gồm trong cồn 96o. Nested ext-1 (5’-TAT GCA GTA CTT TCC 2.2. Quy trình semi-nested RT-PCR chẩn CTG CC-3’), ME1 (5’-GTT GGG CAC AAG đoán TiLV với bộ mồi Random hexamer và GCA TCC TA-3’) và 7450/150R/ME2 (5’- OligodT TAT CAC GTG CGT ACT CGT TCA GT-3’) 2.2.1. Tách chiết RNA (Eyngor et al., 2014; Kembou Tsofack et al., RNA virus được tách chiết từ mẫu cá 2017; Dong et al., 2017) là quy trình phổ biến, bằng dung dịch Trizol. Mô cá nhiễm TiLV (10 hiện được các Trung tâm chẩn đoán virus TiLV mg) hoặc 200 µL dịch nuôi cấy virus TiLV- sử dụng. Trong quy trình này, phản ứng tổng TL trên tế bào E11 được trộn với trong 1 mL hợp cDNA được tiến hành với bộ kit RevertAid TRISure (Bioline) và đồng nhất bằng máy First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Qiagen TissueLyserII ở tần số rung (Oscillation Scientific™), gồm 5 μl mẫu RNA (100–400 frequency) 50 Hz/giây trong thời gian 1 phút ng), 0,4 μM mỗi mồi Nested ext-1 và ME1, 1 ở 4oC. Sau khi đồng nhất, mẫu được ủ ở nhiệt mM dNTP, 1 μl Reverse Transcriptase, 1 μl độ phòng trong 5 phút và bổ sung thêm 100 µL RiboLock RNAse inhibitor và 1X dung dịch BCP (Merck), lắc mạnh tuýp trong 15 giây và đệm trong tổng thể tích 20 μl. Chương trình tiếp tục ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Mẫu nhiệt gồm 25oC 10 phút, 50oC 30 phút và 94oC ở được ly tâm ở tốc độ 20.000 xg trong 15 phút ở 2 phút. Sau đó sản phẩm cDNA được khuếch đại 4°C sẽ tách các pha. Phần pha nổi bên trên được bằng phản ứng Nested PCR với cặp mồi ngoài chuyển qua tuýp 1,5 mL mới (khoảng 300-500 Nested ext-1 và ME1 (PCR1, 415 bp) và cặp µL). Lượng isopropanol lạnh tương đương thể mồi trong 7450/150R/ME2 và ME1 (PCR2, 250 tích mẫu được bổ sung để tủa RNA. Các tuýp bp) bằng bộ kit DreamTaq Green PCR master được đảo đều 5-7 lần và ly tâm ở tốc độ 20.000 mix (Thermo Scientific). Phản ứng PCR 1 gồm xg trong 15 phút ở 4°C. Cặn ở đáy tube được 1,5 μL cDNA, 0,4 μM mỗi mồi Nested ext-1 rửa với 1 mL ethanol 75% lạnh và tiếp tục ly và ME1, 1X DreamTaq Green PCR master mix tâm ở 20.000 xg trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. trong tổng thể tích 25 μL. Chương trình nhiệt TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 47
4. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II gồm một chu kỳ 94oC trong 2 phút 25 chu kỳ 0,5 μM mồi TiLV/nSeg1F và 0,6 μM mồi TiLV/ với 94°C trong 30s, 60°C trong 30s, 72°C trong nSeg1RN, 1 X DreamTaq Green PCR master 30s, và một chu kỳ 72oC trong 5 phút. Phản mix. Chương trình nhiệt tương tự như phản ứng ứng PCR2 được tiến hành trong thể tích 20 μL PCR1. gồm có 1 μL sản phẩm PCR1, 0,25 μM mỗi mồi Ngoài ra, việc sử dụng cặp mồi Random 7450/150R/ME2 và ME1, 1 X DreamTaq PCR hexamer (5´ – d (NNNNNN) –3´ N = G, A, T master mix. Chương trình nhiệt tương tự như or C) và OligodT (5´-d (TTT TTT TTT TTT phản ứng PCR1 (Dong et al., 2017a). TTT TTT)-3´) để tổng hợp cDNA thay cho các Quy trình RT-PCR khuếch đại đoạn trình cặp mồi đặc hiệu với đoạn trình tự số 1 và số tự thứ 1 của TiLV được thiết kế với bộ mồi 3 nhằm tối ưu quy trình chẩn đoán TiLV. Phản gồm TiLV/nSeg1F (5′-TCT GAT CTA TAG ứng tổng hợp cDNA gồm được tiến hành với bộ TGT CTG GGC C-3′), TiLV/nSeg1R (5′-AGT kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, CAT GCT CGC TTA CAT GGT-3′) và TiLV/ gồm 5 μL mẫu RNA (100 ng), 0,4 μM mỗi mồi nSeg1RN (5′- CCA CTT GTG ACT CTG AAA Random hexamer và OligodT, 1 mM dNTP, 1 μl CAG -3′) (Dong et al., 2020; Taengphu et al., Reverse Transcriptase, 1 μl RiboLock RNAse 2020). Quy trình mới này có độ nhạy cao gấp inhibitor và 1X dung dịch đệm trong tổng thể 100 lần so với quy trình RT-PCR trên đoạn trình tích 20 μl. Chương trình nhiệt gồm 25oC trong tự số 3 của TiLV. Trong quy trình này, phản 10 phút, 45oC trong 60 phút và 85oC ở 5 phút. ứng tổng hợp cDNA được tiến hành với bộ kit Sau đó sản phẩm cDNA được khuếch đại với 02 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit, bộ mồi liên quan đến đoạn trình tự số 1 và số 3 gồm 5 μl mẫu RNA (100 ng), 0,4 μM mỗi mồi của TiLV với quy trình PCR tương tự như trên. TiLV/nSeg1F và TiLV/nSeg1R, 1 mM dNTP, Mẫu RNA của chủng TiLV-TL nuôi cấy trên 1 μl Reverse Transcriptase, 1 μl RiboLock dòng tế bào E-11 được dùng để so sánh hiệu quả RNAse inhibitor và 1X dung dịch đệm trong khuếch đại của các quy trình với nhau. Chứng tổng thể tích 20 μl. Chương trình nhiệt gồm dương là mẫu RNA của virus TiLV-RIA2, trong 25oC 10 phút, 50oC 30 phút và 94oC ở 2 phút. khi đó, chứng âm là mẫu nước. Sản phẩm PCR Sau đó sản phẩm cDNA được khuếch đại bằng được kiểm tra trên gel agarose 1% chứa với 1X phản ứng Nested PCR với cặp mồi ngoài TiLV/ dung dịch GelRed® 10,000X (Biotum) trong nSeg1F và TiLV/nSeg1R (PCR1, 620 bp) và dung dịch đệm TAE 0,5X (20 mM Tris (Merck), cặp mồi trong TiLV/nSeg1F và TiLV/nSeg1RN 10 mM acetic acid (Merck), and 0.5 mM EDTA (PCR2, 274 bp). Phản ứng PCR 1 gồm 1,5 μL (Merck)). Kết quả điện di được quan sát bằng cDNA, 0,4 μM mỗi mồi TiLV/nSeg1F và TiLV/ máy chụp ảnh gel điện di (GelDoc-it2, UVP). nSeg1R, 1X DreamTaq Green PCR master mix 2.3. Thu mẫu cá rô phi nhiễm TiLV tại trong tổng thể tích 25 μL. Chương trình nhiệt Việt Nam gồm trình nhiệt gồm một chu kỳ 94oC trong 2 Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thu thập phút, 25 chu kỳ với 94°C trong 30s, 60°C trong mẫu cá rô phi nghi ngờ nhiễm TiLV thông qua 30s, 72°C trong 30s, và một chu kỳ 72oC trong các dấu hiệu bệnh lý như xuất huyết, lở loét 2 phút. Phản ứng PCR2 được tiến hành trong thân, bụng phình, tróc vảy, mắt lồi (Dong et thể tích 25 μL gồm có 5 μL sản phẩm PCR1, al., 2017b; Ferguson et al., 2014; Jansen and 48 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
5. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Mohan, 2017; Surachetpong et al., 2017) tại các Để thu virus từ mẫu bệnh phẩm, các mẫu trại nuôi cá rô phi ở Tp. HCM và Vĩnh Long. mô dương tính với TiLV được đồng nhất trong Các mẫu cá chết được vận chuyển trong đá lạnh dung dịch Hank’s balanced salt solution (HBSS, (trong vòng 24 giờ) về Trung tâm Công nghệ Thermo Fisher Scientific) và sau đó ly tâm ở sinh học Tp. HCM. Mẫu gan, thận, lách và não 3.000 xg trong 10 phút ở 4oC (Tattiyapong et al., của các mẫu cá nghi ngờ nhiễm TiLV được thu, 2017). Dịch nổi được thu và lọc qua màng lọc trộn chung và chia làm hai phần để bảo quản ở 0,22 μm. Sau đó, 0,5 – 1 mL dịch virus sau lọc -80oC và trong cồn 96o. được bổ sung vào đĩa nuôi cấy 6 giếng chứa tế Mẫu mô cá bảo quản trong cồn 96o được bào E-11 lớp đơn chiếm 70 – 80% diện tích đĩa kiểm tra sự hiện diện của TiLV bằng quy trình và ủ ở 25oC trong 14 ngày. Mật độ tế bào được semi-nested RT-PCR đã trình bày ở Mục 2.2. quan sát hàng ngày. Khi trong bình nuôi cấy Đối với các mẫu mô cá ở 96o dương tính với có hiệu ứng hủy hoại tế bào (CPE, cytopathic TiLV, mẫu mô tương ứng bảo quản ở -80oC effect) với mật độ tế bào bị ly giải từ 50 – 90%, được sử dụng để nuôi cấy virus TiLV trên dòng dịch nổi sẽ được lọc qua màng lọc 0,22 μm, cấy tế bào E-11. chuyền sang các giếng tế bào E-11 mới với tỷ 2.4. Nuôi cấy virus TiLV trên dòng tế bào lệ thể tích 1:1. Để thu virus, dịch nổi ở lần cấy E-11 chuyền thứ 2 và 3 với dấu hiệu CPE rõ ràng 2.4.1. Nuôi cấy tế bào E-11 sẽ được lọc qua màng lọc 0,22 μm và chia vào Dòng tế bào E-11 (tế bào từ cá lóc nhiều tuýp để bảo quản ở -80oC. Dịch nuôi cấy Ophicephalus striatus) là dòng tế bào nhạy cảm virus được kiểm tra sự hiện diện của TiLV bằng với TiLV. Tế bào bảo quản ở -80oC (khoảng quy trình semi-nested RT-PCR (Mục 2.2) và cấy 106 tế bào mL-1) được rã đông nhanh ở 37oC và chuyền sang bình tế bào mới nhằm mục đích chuyển vào môi trường Liebovitz L-15 (Bioind) duy trì sự tồn tại của virus cho các nghiên cứu ở nhiệt độ phòng. Tiến hành loại bỏ môi trường sâu hơn sau này. đông lạnh bằng cách ly tâm với tốc độ 450 xg III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ở 25oC trong 5 phút. Cặn tế bào được huyền 3.1. Quy trình semi-nested RT-PCR chẩn phù trong môi trường L-15 bổ sung 5% huyết đoán TiLV với bộ mồi Random hexamer và thanh bò (fetal bovine serum, FBS, Sigma) và 2 OligodT mM L-glutamine (Sigma) với mật độ 3 x 105 tế Khi sử dụng cùng 01 mẫu RNA để so sánh bào/cm2 và ủ ở 25oC trong điều kiện không có khả năng chẩn đoán TiLV của quy trình semi- CO2. Thay môi trường L-15 + 5%FBS + 2mM nested RT-PCR trên đoạn trình tự số 3 và số L-glutamine khi tế bào mọc lan 50% diện tích 1 theo công bố bởi Dong et al., (2017); Dong đĩa nuôi cấy. Khi tế bào E-11 phát triển thành et al., (2020); Taengphu et al., (2020) với quy một lớp đơn liên tục (monolayer) chiếm 70 – trình có sự điều chỉnh ở phản ứng tạo cDNA 80% diện tích đĩa nuôi cấy, tế bào được cấy với cặp mồi Random hexamer/OligodT, kết quả chuyền sang đĩa mới hoặc cảm nhiễm với virus cho thấy khả năng phát hiện TiLV tốt nhất ở quy TiLV. trình RT-PCR sử dụng bộ mồi Random hexamer/ 2.4.2. Cảm nhiễm tế bào E-11 với virus OligodT/Nested ext-1/ME1/ 7450/150R/ME2 TiLV (Hình 1). Quy trình điều chỉnh này được nhóm TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 49
6. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II nghiên cứu sử dụng cho các đợt kiểm tra TiLV PCR khuếch đại đoạn trình tự thứ 1 của TiLV sau này. với bộ mồi gồm TiLV/nSeg1F, TiLV/nSeg1R, Căn cứ trên bộ gen TiLV, một số phương TiLV/nSeg1RN được Taengphu và ctv. (2020) pháp PCR đã được thiết lập như RT-PCR (Eyngor đánh giá là nhạy hơn bộ mồi khuếch đại đoạn et al., 2014), nested RT-PCR (Kembou Tsofack trình tự số 3 (Dong et al., 2017), nhưng kết quả et al., 2017), semi-nested RT-PCR (Dong et so sánh hiện tại của đề tài thì lại cho thấy điều al., 2017a; Taengphu et al., 2020), RT-qPCR ngược lại. Việc khảo sát trên quy mô mẫu lớn (Kembou Tsofack et al., 2017; Tattiyapong et hơn và nồng độ mẫu khác nhau cần được triển al., 2017; Waiyamitra et al., 2018) và RT-LAMP khai để kiểm chứng thêm về độ nhạy và độ đặc (Phusantisampan et al., 2019; Yin et al., 2019). hiệu của các quy trình semi-nested RT-PCR với Hầu hết các phương pháp này đều hướng đến bộ mồi Random hexamer/OligodT/Nested ext- đoạn trình tự 3 của TiLV. Mặc dù quy trình RT- 1/ME1/ 7450/150R/ME2. Hình 1. Kết quả chẩn đoán TiLV của các quy trình semi-nested RT-PCR căn cứ trên đoạn trình tự số 3 (Ex1/ME1) của Dong et al., (2017), trên đoạn trình tự số 1 (nSeq1F/R) của Taengphu et al., (2020) và quá trình tổng hợp cDNA có điều chỉnh với cặp mồi random hexamer/oligodT. M: thang DNA 1kb (Thermo); 1: mẫu RNA của TiLV-TL tách bằng phương pháp Trizol; 2: mẫu RNA của TiLV-TL, tách bằng QIAmp Viral RNA Mini; 3: mẫu TiLV-RIA2; (-): chứng âm. 3.2. Phân lập và nuôi cấy chủng Từ tháng 08/2019 đến tháng 06/2020, TiLV Việt Nam nhóm nghiên cứu cũng đã tiến hành 04 đợt thu 3.2.1. Thu thập mẫu cá nhiễm TiLV thập mẫu cá rô phi nghi ngờ nhiễm TiLV tại các 50 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
7. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II bè nuôi cá rô phi ở Tp. HCM (04 mẫu) và Vĩnh 5/2019 và cũng là nơi thu được mẫu cá dương Long (47 mẫu) (Bảng 1). Bè nuôi cá rô phi tại tính TiLV của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Tp. HCM từng nhiễm TiLV vào khoảng tháng Thủy sản II. Bảng 1. Danh sách các mẫu cá rô phi nghi nhiễm TiLV thu tại Tp. HCM và Vĩnh Long. Kết quả Trọng Nguồn gốc Thời gian thu TT Ký hiệu Loài cá chẩn đoán lượng cá mẫu mẫu TiLV 1 Q3 Rô phi vằn 100 g Tp. HCM 08/2019 (-) 2 Q4 Rô phi vằn 100 g Tp. HCM 08/2019 (-) 3 Q130 Rô phi vằn 300 g Tp.HCM 06/2020 (-) 4 Q134 Rô phi vằn 30 g Tp.HCM 06/2020 (-) 5 VL1 Điêu hồng 210 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 6 VL2 Điêu hồng 36 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 7 VL3 Điêu hồng 186 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 8 VL4 Điêu hồng 53 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 9 VL5 Điêu hồng 122 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 10 VL6 Điêu hồng 127 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 11 VL7 Điêu hồng 55 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 12 VL8 Điêu hồng 47 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 13 VL9 Điêu hồng 112 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 14 VL10 Điêu hồng 52 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 15 VL11 Điêu hồng 66 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 16 VL12 Điêu hồng 67 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 17 VL13 Điêu hồng 179 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 18 VL14 Điêu hồng 22 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 19 VL15 Điêu hồng 73 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 20 VL16 Điêu hồng 52 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 21 VL17 Điêu hồng 226 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 22 VL18 Điêu hồng 59 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 23 VL19 Điêu hồng 156 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 24 VL20 Điêu hồng 101 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 25 VL21 Điêu hồng 141 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 26 VL22 Điêu hồng 133 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 27 VL23 Điêu hồng 116 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 28 VL24 Điêu hồng 146 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 29 VL25 Điêu hồng 182 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 30 VL26 Điêu hồng 176 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 31 VL27 Điêu hồng 164 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 32 VL28 Điêu hồng 92 g Vĩnh Long 03/2020 (-) TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 51
8. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Kết quả Trọng Nguồn gốc Thời gian thu TT Ký hiệu Loài cá chẩn đoán lượng cá mẫu mẫu TiLV 33 VL29 Điêu hồng 170 g Vĩnh Long 03/2020 (-) 34 VL156 Điêu hồng 600 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 35 VL157 Điêu hồng 350 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 36 VL158 Điêu hồng 270 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 37 VL159 Điêu hồng 400 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 38 VL160 Điêu hồng 350 g Vĩnh Long 06/2020 (+) 39 VL161 Điêu hồng 400 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 40 VL162 Điêu hồng 520 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 41 VL163 Điêu hồng 90 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 42 VL164 Điêu hồng 70 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 43 VL165 Điêu hồng 70 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 44 VL166 Điêu hồng 70 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 45 VL167 Điêu hồng 70 g Vĩnh Long 06/2020 (+) 46 VL168 Điêu hồng 60 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 47 VL169 Điêu hồng 70 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 48 VL170 Điêu hồng 50 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 49 VL171 Điêu hồng 40 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 50 VL172 Điêu hồng 40 g Vĩnh Long 06/2020 (-) 51 VL173 Điêu hồng 35 g Vĩnh Long 06/2020 (-) Sau khi mẫu chuyển về Trung tâm CNSH Kết quả RT-PCR cho thấy chỉ có mẫu VL160 và Tp. HCM, sự hiện diện của TiLV trong 51 mẫu VL167 dương tính với virus TiLV, các mẫu còn mô cá được kiểm tra bẳng RT-PCR (Hình 2 – 3). lại (49/51 mẫu) đều cho kết quả âm tính. Hình 2. Kiểm tra sự hiện diện của TiLV trên mẫu mô cá nghi nhiễm TiLV thu tại Tp. HCM bằng quy trình semi nested RT-PCR. M: thang DNA Hyperladder 1kb (Bioline); 1: Q3; 2: Q4; 3: Q130; 4: Q134; 5, 6: Chứng âm; 7: mẫu virus TiLV-TL. 52 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
9. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 3. Kiểm tra sự hiện diện của TiLV trên mẫu mô cá nghi nhiễm TiLV thu tại Vĩnh Long (VL156 – VL173) bằng quy trình semi nested RT-PCR. M: thang DNA O’Generuler 1kb (Thermo); (+): mẫu virus TiLV- RIA2; (-): Chứng âm. Dịch bệnh TiLV thường xảy ra vào mùa Mẫu cá rô phi VL160 và VL167 dương tính nóng từ tháng Năm đến tháng Mười hàng năm với TiLV được sử dụng để cảm nhiễm dòng tế (Kembou Tsofack et al., 2017). Đa số các đợt bào E-11 nhằm mục đích phân lập và nuôi cấy lấy mẫu của nghiên cứu này đều rơi vào khoảng virus TiLV Việt Nam phục vụ cho các nghiên mùa hè với nhiệt độ cao. Đồng thời, vào những cứu chuyên sâu sau này. Cả hai mẫu VL160 và thời điểm thu mẫu, hiện tượng nước bị đục tại VL167 đều cho thấy sự ly giải tế bào với các khu vực nuôi cá đều ghi nhận được. Đây có thể dấu hiệu đặc trưng do virus TiLV gây ra như là một trong các yếu tố môi trường gây stress và những vệt tan xuất hiện trên lớp đơn tế bào E11 khiến cá dễ nhiễm bệnh. Tuy nhiên, số mẫu cá (vật kính 4x) lan dần đến khi toàn bộ E11 bị rô phi bệnh dương tính với TiLV có tỷ lệ thấp ly giải hết. Ở vật kính 20x, các tế bào E11 có (2/51 mẫu, chiếm 3,9%) và mức độ nhiễm yếu hiện tượng bị co tròn và bong tróc khỏi bề mặt theo đánh giá cảm quan thông qua kết quả điện bình nuôi cấy. Mẫu VL167 đã ly giải 80% tế di các sản phẩm RT-PCR (Hình 2 - 3). Điều này bào chỉ sau 02 ngày cảm nhiễm, trong khi đó cho thấy dịch bệnh TiLV ở các trại nuôi cá rô mẫu VL160 có tốc độ ly giải tế bào chậm hơn, phi ở Tp. HCM và Vĩnh Long chưa hiện diện đến ngày thứ 8 thì mới ly giải được 80-90% tế nhiều và mạnh; do đó, hiện chưa gây ra dịch lớn bào (Hình 4). Sau khi 89-90% tế bào bị ly giải, và tổn thất nghiêm trọng. phần dịch nổi được thu để kiểm tra sự hiện diện 3.2.2. Nuôi cấy virus TiLV từ mẫu cá rô của TiLV và cấy chuyền sang các bình nuôi cấy phi nuôi tại Việt Nam tế bào tiếp theo. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 53
10. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 4. Hình ảnh sau 2-8 ngày cảm nhiễm tế bào E-11 với dịch đồng nhất mẫu VL160 và VL167. Dấu (*): vệt tan trên tế bào, dấu hiệu ly giải tế bào đặc trưng ở vật kính 4X. Dấu (→): tế bào bị co tròn và bong tróc ở vật kính 20x. dpi: số ngày sau khi cảm nhiễm virus vào tế bào (day post infection). Kết quả semi-nested RT-PCR có sự tồn tại được tế bào E-11 qua 2 đợt cấy chuyền (P1, P2) và của TiLV trong dịch ly giải tế bào sau khi cảm không ly giải tế bào ở lần cấy chuyền thứ 3 (P3). nhiễm ở cả hai mẫu VL160 và VL167 (Hình 5). Trong khi đó, chủng VL167 chỉ ly giải tế bào trong Điều này cho thấy hai chủng virus TiLV VL160 lần nuôi cấy đầu tiên (P1) và không tiếp tục ly giải và VL167 đã được phân lập và bước đầu nuôi cấy tế bào E-11 khi cấy chuyền lần 2 (P2). Bên cạnh thành công. Tuy nhiên, tốc độ ly giải tế bào của hai đó, dịch nuôi cấy virus P1 bảo quản ở -80oC của chủng này ngày càng chậm và yếu dần qua các đợt cả 02 chủng mất khả năng ly giải tế bào sau khi rã cấy chuyền (Hình 6). Chủng VL160 vẫn ly giải đông và nuôi cấy trong bình tế bào E-11 mới. 54 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
11. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Theo các nghiên cứu trước đây, việc cảm yếu (Hình 3), chỉ được phát hiện ở PCR bước nhiễm tế bào E-11 với dịch đồng nhất mẫu cá 2 của quy trình semi-nested RT-PCR với vạch nghi nhiễm TiLV cũng là một phương pháp mờ. Mặc dù, chủng TiLV ở hai mẫu này được chẩn đoán TiLV có độ chính xác tương đương nuôi cấy thành công trên tế bào E-11, nhưng khi phản ứng nested RT-PCR (Kembou Tsofack et cấy chuyền qua đợt hai và ba, nhóm nghiên cứu al., 2017). Nhiều dòng tế bào khác cũng đã được nhận thấy hàm lượng virus có sự giảm sút dần dùng để nuôi cấy TiLV, như tế bào não cá rô cho đến khi sự ly giải tế bào không xảy ra nữa. phi ban sơ (Eyngor et al., 2014a), OmB, TmB Điều này có thể do hai nguyên nhân: một là, hai (Kembou Tsofack et al., 2017), CFF (Behera et chủng TiLV Việt Nam này có hoạt lực yếu nên al., 2018), OnlB, OnlL (Thangaraj et al., 2018). không duy trì được khả năng xâm nhiễm tế bào Trong đó, Thangaraj và ctv. (2018) đã duy trì qua các đợt cấy chuyền, vì mẫu TiLV-Thái Lan thành công virus TiLV qua 20 đợt cấy chuyền đối chứng vẫn được cấy chuyền tốt qua nhiều trên dòng tế bào não (OnlB) và gan (OnlL) của đợt (dữ liệu này không được trình bày trong cá rô phi. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu bài báo này); hai là, cần xác định thời điểm thu trước đây đều chưa đề cập đến tỷ lệ mật độ virus virus thích hợp trước khi cấy chuyền vì TiLV TiLV so với mật độ tế bào nuôi cấy để đảm bảo dường như không tồn tại được lâu trong môi quá trình ly giải xảy ra tốt nhất, và thời điểm thu trường nuôi cấy khi thiếu tế bào để xâm nhiễm. virus thích hợp nhất (dựa vào phần trăm tế bào Do đó, quy trình nuôi cấy TiLV cần được tìm bị ly giải, trong khoảng 50 - 90%) trước khi cấy hiểu và tối ưu hơn trong thời gian tới để lưu giữ chuyền để thu được lượng virus cao nhất. được chủng TiLV Việt Nam cho các nghiên cứu Trong nghiên cứu hiện tại, hai mẫu cá sâu hơn sau này. VL160 và VL167 đều có mức độ nhiễm TiLV Hình 5. Kiểm tra sự hiện diện của TiLV trong các dịch nuôi cấy mẫu mô đồng nhất VL160-P1 và VL167-P1 bằng quy trình semi-nested RT-PCR. M: thang DNA O’Generuler 1kb (Thermo); (+): mẫu virus TiLV- RIA2. * TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 55
12. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 6. Thời gian ly giải 80-90% tế bào của các chủng TiLV VL160 (A) và VL167 (B) qua các đợt cấy chuyền trong khoảng thời gian từ 01/07/2020 đến 31/07/2020. P: đợt cấy chuyền (passage); dpi: số ngày sau khi cảm nhiễm virus vào tế bào (day post infection). V. KẾT LUẬN trung tại hai tỉnh thành, nhưng kết quả chẩn đoán Virus TiLV đã được phát hiện tại các quốc TiLV cũng phản ánh phần nào tình trạng nhiễm gia trên thế giới, nhưng hiện có rất ít công bố TiLV tại các trại nuôi cá rô phi tại khu vực phía liên quan đến TiLV phân lập tại Việt Nam. Trong Nam. Cụ thể là, dịch bệnh do TiLV gây ra tại nghiên cứu này, dù số lượng mẫu còn ít và tập đây chưa xuất hiện nhiều, chưa có tình trạng lây 56 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
13. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II lan rộng khắp trại cá, chưa ở mức nghiêm trọng, và Phát triển nông thôn. Tại trang: có vẻ xảy ra theo mùa trong năm và phụ thuộc cucthuy.gov.vn/Pages/cong-van-so-1357-ty-ts-v- v-huong-dan-phong-chong-benh-do-tilv-tren-ca- vào các yếu tố môi trường (như nhiệt độ cao, ro-phi-.aspx (xem ngày 11/01/2021). nước bị đục). Bên cạnh đó, nghiên cứu này đã Tài liệu tiếng Anh bước đầu tăng hiệu quả chẩn đoán của TiLV ở Acharya, V., Chakraborty, H.C., Rout, A.K., các mẫu có mức độ nhiễm virus yếu với quy Balabantaray, S., Behera, B.K. & Das, B.K., trình semi-nested RT-PCR bằng cách sử dụng 2019. “Structural Characterization of Open Reading Frame-Encoded Functional Genes cặp mồi Random hexamer/OligodT trong phản from Tilapia Lake Virus (TiLV)”, Molecular ứng tổng hợp cDNA. Tuy nhiên, độ nhạy chính Biotechnology, 61, tr.945-957. xác của quy trình này cần được định lượng bằng Bacharach, E., Mishra, N., Briese, T., Zody, M. bộ mẫu chuẩn với số lượng bản sao TiLV khác C., Kembou Tsofack, J. E., Zamostiano, R., Berkowitz, A., Ng., J., Nitido, A., Corvelo, A., nhau. Việc phân lập và nuôi cấy TiLV bước đầu Toussaint, N.C., Nielsen, S.C.A., Hornig, M., thành công, nhưng cần phải tìm được mẫu cá Pozo, J. D., Bloom, T., Ferguson, H., Eldar, A. bệnh với mật độ TiLV nhiều hơn; đồng thời điều & Lipkin, W., I., 2016. “Characterization of a chỉnh và tối ưu hóa thêm quy trình cấy chuyền Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die- Offs of Tilapia”,MBio , 7(2), e00431-16. virus nhằm lưu trữ được nguồn TiLV Việt Nam Behera, B. K., Pradhan, P. K., Swaminathan, T. R., phục vụ cho các nghiên cứu sâu hơn sau này. Sood, N., Paria, P., Das, A., Verma, D.K., Kumar, LƠI CẢM ƠN R., Yadav, M.K., Dev, A.K., Parida, P.K., Das, Các kết quả nghiên cứu trong bài báo này B.K., Lal, K.K. & Jena, J. K., 2018. “Emergence đều thuộc nhiệm vụ khoa học công nghệ “Phân of Tilapia Lake Virus associated with mortalities of farmed Nile Tilapia Oreochromis niloticus tích hệ gen phiên mã (transcriptome) của cá rô (Linnaeus 1758) in India”, Aquaculture, 484, phi đỏ (Oreochromis spp.) nhằm sàng lọc các tr.168–174. chỉ thị phân tử tiềm năng có liên quan đến tính Del-Pozo, J., Mishra, N., Kabuusu, R., Cheetham, S., kháng virus TiLV (Tilapia Lake virus)” (Mã số: Eldar, A., Bacharach, E., Lipkin, W.I. & Ferguson, H. W., 2017. “Syncytial Hepatitis of Tilapia ( TS01/19-21) do Sở Nông nghiệp và Phát triển Oreochromis niloticus L.) is Associated With Nông thôn Tp. HCM cấp kinh phí. Orthomyxovirus-Like Virions in Hepatocytes”, TÀI LIỆU THAM KHẢO Veterinary Pathology, 54(1), tr.164–170. Tài liệu tiếng Việt Dong, H.T., Siriroob, S., Meemetta, W., Chi cục Chăn nuôi, Thú y và Thủy sản tỉnh Bình Santimanawong, W., Gangnonngiw, W., Dương, 2017. Phòng, chống bệnh mới do Tilapia Pirarat, N., Khunrae, P., Rattanarojpong, T., lake virus (TiLV) trên cá rô phi tại Việt Nam. Vanichviriyakit, R. & Senapin, S., 2017a. Tại trang: “Emergence of tilapia lake virus in Thailand phong-chong-benh-moi-do-tilapia-lake-virus- and an alternative semi-nested RT-PCR for tilv-tren-ca-ro-phi-tai-viet-nam-958.html (xem detection”, Aquaculture, 476, tr.111–118. ngày 31/12/2020). Dong, H.T., Siriroo, S., Meemetta, W., Cục Thú y, 2017a. “Công văn số 8862/BNN-TY ngày Santimanawong, W., Gangnonngiw, W., 20/10/2017 về chỉ đạo áp dụng các biện pháp Pirarat, N., Khunrae, K., Rattanarojpong, T., cấp bách phòng, chống dịch bệnh mới do TiLV Vanichviriyakit, R., Senapin, S.11. Dong, H.T., gây ra trên cá rô phi”, Cục Thú y Việt Nam, Bộ Siriroo, S., Meemetta, W., Santimanawong, W., Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. Tại trang: Gangnonngiw, W., Pirarat, N., Khunra, S., 2017b. “A warning and an improved PCR detection 8862-bnn-ty.aspx (xem ngày 11/01/2021). method for tilapia lake virus (TiLV) disease in Cục Thú y, 2017b. “Công văn số 1357/TY-TS về Thai tilapia farms”, Network of Aquaculture hướng dẫn phòng, chống bệnh do TiLV trên cá Centres in Asia-Pacific. Retrieved from http:// rô phi”. Cục Thú y Việt Nam, Bộ Nông nghiệp www.enaca.org. TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 57
14. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Dong, Ha Thanh, Senapin, S., Gangnonngiw, W., ullEventReport&reportid=23836 (available on Nguyen, V. V., Rodkhum, C., Debnath, P. P., 11/01/2021) Delamare-Deboutteville, J. & Mohan, C. V., 2020. OIE, 2017b. “Tilapia Lake Virus (TiLV), “Experimental infection reveals transmission of Philippines”, Immediate Notification. Retrieved tilapia lake virus (TiLV) from tilapia broodstock from to their reproductive organs and fertilized eggs”, php/Reviewreport/Review?page_refer=MapF Aquaculture, 515, tr.734541. ullEventReport&reportid=31034 (available on Eyngor, M., Zamostiano, R., Kembou Tsofack, J. E., 11/01/2021) Berkowitz, A., Bercovier, H., Tinman, S., Lev, OIE, 2017c. “Tilapia Lake Virus (TiLV) – A Novel M., Hurvitz, A., Galeotti, M., Bacharach, E. & Orthomyxo-Like Virus”, World Organisation for Eldar, A., 2014a. “Identification of a Novel RNA Animal Health. Retrieved from Virus Lethal to Tilapia”, Journal of Clinical int/fileadmin/Home/eng/Internationa_Standard_ Microbiology, 52(12), tr.4137–4146. Setting/docs/pdf/A_TiLV_disease_card.pdf Ferguson, H. W., Kabuusu, R., Beltran, S., Reyes, (available on 11/01/2021) E., Lince, J. A., & del Pozo, J., 2014. “Syncytial OIE, 2017d. “Tilapia Lake Virus Disease, Chinese hepatitis of farmed tilapia, Oreochromis niloticus Taipei”, Immediate Notification. Retrieved (L.): a case report”, Journal of Fish Diseases, from 37(6), tr.583–589. php/Reviewreport/Review?reportid=24033 Food and Agriculture Organization off the United (available on 11/01/2021) Nations (FAO), 2017. “Outbreaks of Tilapia OIE, 2017e. “Tilapia Lake Virus Disease, Lake Virus (TiLV) Threaten the Livelihoods and Malaysia”, Immediate Notification. Retrieved Food Security of Millions of People Dependent from on Tilapia Farming”, FAO, Rome. Global php/Reviewreport/Review?page_refer=MapF Information and Early Warning System (GIEWS) ullEventReport&reportid=24809 (available on Special Alert No. 338 - Global, 26 May 2017. 11/01/2021) Retrieved from OIE, 2017f. “Tilapia Lake Virus Disease, Thailand”, card/en/c/3ce1da5b-%0A1529-4e7c-8b88- Immediate Notification. Retrieved from https:// 7adfef8d138c (available on 11/01/2021) www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/ Jansen, M.D. & Mohan, C. V., 2017. “Tilapia lake Reviewreport/Review?page_refer=MapEve virus (TiLV): Literature review”. Penang, ntSummary&reportid=23832 (available on Malaysia: CGIAR Research Program on Fish 11/01/2021) Agri-Food Systems. Working Paper: FISH- OIE, 2018. “Tilapia Lake Virus, Peru”, Immediate 2017-04. Retrieved from: Notification. Retrieved from worldfishcenter.org/handle/20.500.12348/121 int/wahis_2/public/wahid.php/Reviewreport/ (available on 11/01/2021) Review?page_refer=MapFullEventReport&repo Jansen, M. D., Dong, H. T. & Mohan, C. V., 2019. rtid=26027 (available on 11/01/2021) “Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., industry?”, Reviews in Aquaculture, 11, tr.725– Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., & 739. Surachetpong, W., 2019. “Rapid detection Kembou Tsofack, J. E., Zamostiano, R., Watted, S., of tilapia lake virus using a one-step reverse Berkowitz, A., Rosenbluth, E., Mishra, N., Briese, transcription loop-mediated isothermal T., Lipkin, W.I., Kabuusu, R.M., Ferguson, H., amplification assay”,Aquaculture , 507, tr.35–39. del Pozo, J. & Bacharach, E., 2017. “Detection Surachetpong, W., Janetanakit, T., Nonthabenjawan, of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by N., Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., & Culturing and Nested Reverse Transcription- Amonsin, A., 2017. “Outbreaks of Tilapia Lake PCR”, Journal of Clinical Microbiology, 55(3), Virus Infection, Thailand, 2015-2016”, Emerging tr.759–767. Infectious Diseases, 23(6), tr.1031–1033. OIE, 2017a. “Hepatitis sincitial de la tilapia, Taengphu, S., Sangsuriya, P., Phiwsaiya, K., Debnath, Israel”, Immediate Notification. Retrieved from P. P., Delamare-Deboutteville, J., Mohan, C. V., Dong, H.T. & Senapin, S., 2020. “Genetic php/Reviewreport/Review?page_refer=MapF diversity of tilapia lake virus genome segment 1 58 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
15. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II from 2011 to 2019 and a newly validated semi- (TiLV)”, Aquaculture, 492, tr.206–214. nested RT-PCR method”, Aquaculture, 526, Waiyamitra, P., Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., tr.735423. Mongkolsuk, S., Nicholson, P., & Surachetpong, Tattiyapong, P., Dachavichitlead, W., & W., 2018. “A TaqMan RT-qPCR assay for Surachetpong, W., 2017. “Experimental tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia”, infection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in Nile Aquaculture, 497, tr.184–188. tilapia (Oreochromis niloticus) and red tilapia Yin, J., Wang, Q., Wang, Y., Li, Y., Zeng, W., Wu, J., (Oreochromis spp.)”, Veterinary Microbiology, Ren, Y., Tang, Y., Gao, C., Hu, H. & Bergmann, 207, tr.170–177. S. M., 2019. “Development of a simple and rapid Thangaraj, R. S., Ravi, C., Kumar, R., Dharmaratnam, reverse transcription-loopmediated isothermal A., Valaparambil Saidmuhammed, B., Pradhan, amplification (RT-LAMP) assay for sensitive P. K., & Sood, N., 2018. “Derivation of two detection of tilapia lake virus”, Journal of Fish tilapia (Oreochromis niloticus) cell lines for Diseases, 42(6), tr.817–824. efficient propagation of Tilapia Lake Virus TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 59
16. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II MODIFIED SEMI-NESTED RT-PCR DETECTING TILAPIA LAKE VIRUS (TiLV) AND INITIAL ISOLATION OF TiLV VIRUS FROM VIETNAMESE TILAPIA Ngo Huynh Phuong Thao1*, Tran Hanh Triet1, Nguyen Hoang Thuy Vy1, Le Thi Thu Thao1, Bui Nguyen Chi Hieu1, Tran Thi Thanh Huong1, Nguyen Hoang Chi Mai2, Le Hoang The Huy3, Tran Nhut Linh4 ABSTRACT Tilapia Lake virus has been recently identified both in natural and cultured tilapia. This research is one of the first studies on TiLV isolates from Vietnam. During 2019-2020, 51 diseased tilapia samples were collected in Ho Chi Minh city and Vinh Long. Semi-nested RT-PCR confirmed only 02 out of them (3.9%) as TiLV-positive. Culturing these two TiLV-positive tissues (VL160 and VL167) on E-11 cell line provided good cytopathic effects. However, these virus samples did not propagate in the second and third passage; thus, requiring an optimized procedure of subculturing TiLV. Besides, the current study also modified the available semi-nested RT-PCR for detecting TiLV to obtain a better amplification efficacy by replacing the specific primers with Random hexamer/ OligodT in the reaction of cDNA synthesis. Although the sensitivity and specificity of this modified semi-nested RT-PCR needs further investigations on various RNA dilutions, this modified protocol could be applied in diagnostic labs for better results of TiLV detection. Keywords: Tilapia Lake virus, tilapia, semi-nested RT-PCR, E-11 cell line. Người phản biện: TS. Nguyễn Ngoc Phươc Người phản biện: TS. Lê Hông Phươc Ngày nhận bài: 16/11/2020 Ngày nhận bài: 16/11/2020 Ngày thông qua phản biện: 20/12/2020 Ngày thông qua phản biện: 05/12/2020 Ngày duyệt đăng: 25/12/2020 Ngày duyệt đăng: 25/12/2020 1 Biotechnology Center of Ho Chi Minh City 2 University of Science, Vietnam National University Ho Chi Minh City 3 Nguyen Tat Thanh University 4 International University, Vietnam National University Ho Chi Minh City * Email: nhpthao.snn@tphcm.gov.vn; tilv.bc2@gmail.com 60 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020