Nghiên cứu thu nhận fucoidan từ rong sụn Kappaphycus Alvarezii

Nội dung text: Nghiên cứu thu nhận fucoidan từ rong sụn Kappaphycus Alvarezii

1. Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học NGHIÊN CỨU THU NHẬN FUCOIDAN TỪ RONG SỤN KAPPAPHYCUS ALVAREZII Lê Thị Mỹ Ngọc*, Nguyễn Thị Minh Chi, Nguyễn Phạm Cẩm Tiên, Đinh Thị Huyền, Hoàng Thị Ngọc Nhơn Trường Đại học Công nghiệp thực phẩm TP. Hồ Chí Minh *Tác giả liên lạc: myngocdhtp198@gmail.com TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, tiến hành các nghiên cứu phương pháp kết tủa fucoidan từ rong sụn (Kappaphycus alvarezii), sau đó tinh sạch fucoidan bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion, thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp DPPH và ABTS, hoạt tính kháng khuẩn (Bacillus cereus, Escherichiacoli) và kháng mốc (Aspergillus niger, Aspergillus flavus) từ các phân đoạn thu được. Các phân đoạn được chọn khi qua sắc ký trao đổi ion có độ tinh sạch cao từ 49.02% - 61.14%. Tổng hàm lượng fucoidan sau tinh sạch với hiệu suất thu hồi đạt 60.99%. Ngoài ra, phân đoạn fucoidan sau sắc kí trao đổi ion còn có hoạt tính kháng khuẩn (Bacillus cereus, Escherichiacoli) với MIC là 380 μg/ml và kháng mốc (Aspergillus niger, Aspergillus flavus) với MIC lần lượt là 680 μg/ml và 580 (μg/ml), khả năng bắt gốc tự do DPPH với IC50 đạt 303.51 (μg/ml), ABTS với IC50 đạt 299.97 (μg/ml). Từ khóa: Fucoidan, rong sụn, tinh sạch, hoạt tính sinh học. RESEARCH FUCOIDAN FROM KAPPAPHYCUS ALVAREZII Le Thi My Ngoc*, Nguyen Thi Minh Chi, Nguyen Phạm Cam Tien, Dinh Thi Huyen, Hoang Thi Ngoc Nhon Ho Chi Minh City University of Food Industry *Corresponding Author: myngocdhtp198@gmail.com ABSTRACT In this study, the effects of prepitation fucowidan method were investigated Kappaphycus alvarezii. Fucoidan fractions which ere obtained after ion-exchange chromatography purifications were tested the antioxidants activity by DPPH and ABTS, as well as, antibacterial and antifungal activity. As a result, fractions which were collected from ion-exchange chromatography had remarkable proportion of purification from 49.02% - 61.14%, extraction yield was 60.99% for all fractions. Moreover, fucoidan fractions also had an antibacterial (Bacillus cereus, Escherichiacoli) and antifungal (Aspergillus niger, Aspergillus flavus) activities with the minimum inhibitory concentrations (MICs) were 380 μg/ml, 680 μg/ml and 580 μg/ml, respectively. Antioxidant activies by ABTS method reached 299.97 ± 1.75 µg/ml (IC50 value), whereas DPPH free radical scavenging activity with IC50 value was 303.51 ± 1.65 µg/ml. Keywords: Fucoidan, kappaphycus alvarezii, purifications, biological activity. TỔNG QUAN Trong rong sụn hàm lượng nước chiếm Rong sụn thuộc ngành tảo đỏ đây là 77 - 91% còn lại là phần trăm chất khô. loài rong biển có giá trị kinh tế cao. Trong chất khô chứa chủ yếu là glucid, 559
2. Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học protein, chất khóa ng, lipip, sắc tố, al., 2008). enzim và cacbohydrat Hàm lượng Khảo sát phương pháp kết tủa trước cacbohydrate dao động từ 50-60% và tinh sạch fucoidan (T. Marudhupandi thường tập trung chủ yếu ở thành tế et al., 2014): bào gồm có cellulose và các loại đường Phương pháp 1: Kết tủa 1 giai đoạn, có hoạt tính sinh học (N. H. Dinh, tiến hành kết tủa fucoidan từ dịch trích 1991).Nhưng chưa có nhiều nghiên với ethanol 99%. cứu về cách khai thác các hợp chất quý Phương pháp 2: Kết tủa 2 giai đoạn, này. Fucoidan là một sulfate tiến hành kết tủa fucoidan với ethanol polysacharide dị thể với thành phần 99% để nồng độ cồn trong dung dịch là cấu tạo hết sức phức tạp. Fucoidan đầu 30% (4 giờ), và 70% (12 giờ). tiên được phân lập xác định là một Khảo sát quá trình tinh sạch polysacharide có chứa L-fucose và D- fucoidan bằng phương pháp sắc kí xylose. Fucoidan là một hợp chất đa trao đổi ion dạng về công thức cấu tạo nên có nhiều Thực hiện nhồi cội sắc ký trao đổi ion hoạt tính sinh học đáng được quan tâm với 3g DEAE – Cellulose, chỉnh tốc độ như: Kháng đông tụ máu, kháng huyết dòng 5ml/10phút. Rửa giải lần lượt khối, kháng virut, chống kết dính tế bằng dung dịch đệm bổ sung NaCl. Ở bào, chống tạo mạch (antiangiogenic), mỗi nồng độ NaCl tiến hành rửa giải kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể 30ml, tăng nồng độ muối NaCl cao hơn (anticomplementary), điều biến hệ để tiếp tục quá trình rửa giải cho đến miễn dịch ( B. Li et al., 2008). Do đó, nồng độ cuối. Các loại đệm được khảo fucoidan đã trở thành đề tài thu hút sát (tris-HCl, phosphate, acetate), nồng được các nhà khoa học trên thế giới với độ muối rửa giải được khảo sát (0.5M; tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các 1M; 1.5M; 2M). Fucoidan được thu lĩnh vực như thực phẩm chức năng, theo từng phân đoạn, mỗi phân đoạn thực phẩm bổ dưỡng và dược liệu. 10ml. Xác định hoạt tính kháng kháng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG mốc, kháng khuẩn PHÁP NGHIÊN CỨU Ống giống vi khuẩn/nấm mốc được Nguyên liệu cấy chuyển vào môi trường TSA/PDA Rong sụn tươi (Kappaphycus để tạo ra các khuẩn lạc/mốc thuần alvarezii) được thu nhận ở Khánh Hòa. riêng rẽ. Dùng que cấy vô trùng lấy 1 Rong được rửa sạch nhiều lần bằng khuẩn lạc/mốc hòa tan vào nước muối nước và loại bỏ các tạp chất bằng rây, sinh lý vô trùng và trộn đều bằng máy sấy đối lưu ở 600C, nghiền thành bột trộn Vortex, mật độ tế bào của dịch bằng máy xay khô. huyền phù được xác định bằng phương Phương pháp nghiên cứu pháp đếm hồng cầu, điều chỉnh mật độ Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: Dịch trích: tế bào trong dịch huyền phù đạt 106 Cân 120g rong cho vào cốc và ngâm CFU/ml. Hút 2ml dịch huyền phù chứa với ethanol 80% trong 12 giờ. Trích ly vi khuẩn có nồng độ 106 CFU/ml cho bã với dung môi HCl (1.38M) 1:40 vào mỗi đĩa thạch. Dùng que cấy trang (w/v), nhiệt độ 880C trong 3.5 giờ. Kết vô khuẩn, trang đều trên mặt thạch sao tủa dịch trích 1 giờ với TCA ở nhiệt độ cho vi khuẩn/nấm mốc khuếch tán đầy lạnh, sau đó ly tâm 5000 vòng/phút trên mặt thạch. Để khô ở nhiệt độ trong 15 phút loại tủa protein để thu phòng trong 30 phút. Nhỏ 10 µl dịch dịch trích ly fucoidan (C. K. Veena et sau tinh sạch đã được pha loãng ở mỗi 560
3. Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học nồng độ khác nhau vào đĩa thạch. Mỗi 0.0074x + 0.0059 nồng độ lặp lại 3 lần, các đĩa thạch Phương pháp xử lý số liệu: Mỗi thí được ủ ở 320C/24h. Đường kính vùng nghiệm được tiến hành lặp lại ba lần, ức chế được đo bằng thước đo đơn vị kết quả được trình bày ở dạng giá trị mm. trung bình ± giá trị sai số. Kết quả được Xác định hoạt tính kháng đông máu tính tóa n bằng phần mềm Microft Hoạt động chống đông của fucoidan Office Excel 2010 và phần mềm SPSS. được xác định theo phương pháp USA Kết quả phân tích ANOVA với độ tin pharmacopia: Hút 0.8 ml dung dịch cậy 95%, so sánh sự khác biệt giữa các fucoidan qua DEAE phân đoạn 1M nghiệm thức qua phép thử LSD. từng nồng độ (600, 500, 400µg/ml). Hút 0.8 ml dung dịch natri heparin KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN chuẩn (0.7 đơn vị USP/0.8 ml) và 0.8 Kết tủa trước tinh sạch fucoidan ml dung dịch muối 96% cho lần lượt Thực hiện trích ly fucoidan theo quy vào từng ống nghiệm. Bổ sung thêm trình (mục 2.2.1) thu được dịch trích có vào trong mỗi ống đã chuẩn bị trên 1 hàm lượng fucoidan 44.25 (µg/ml). ml huyết tương và 0.2 ml dung dịch Hàm lượng và độ tinh khiết của CaCl2 (1%). Đồng nhất hỗn hợp dung fucoidan có trong tủa thực hiện theo dịch trong từng ống. Ghi lại các thời phương pháp 1 là 163.631 (µg/ml) và gian máu được đông. phương pháp 2 là 191.378 (µg/ml). Phương pháp phân tích Hàm lượng và độ tinh khiết fucoidan Thêm 1ml dung dịch fucoidan ở mỗi có trong tủa của phương pháp 2 (tủa 2 nồng độ vào ống nghiệm, làm lạnh ở giai đoạn) cao hơn phương pháp 1 (tủa 40C (2-3 phút). Thêm 4.5 ml acid 1 giai đoạn) (bảng 2.1). Tác giả sunfuric (85%), đun sôi trong 10 phút, T.Marudhupandi và cộng sự (2014) sau đó để nguội, thêm 0.3 ml acid cũng đã sử dụng phương pháp này cysteine hydrochloric 0.1% vào ống trong nghiên cứu về fucoiddan trong nghiệm, ủ trong bóng tối trong 2 giờ, rong biển (T. Marudhupandi et al., sau đó đo độ hấp thụ trên quang phổ kế 2014). ở 396 nm và 430 nm. Mỗi thí nghiệm Hoạt tính kháng oxy hóa của lặp lại 3 lần. Xác định hàm lượng fucoidan từ rong sụn fucoidan có trong mẫu bằng phương Kết quả DPPH hoạt tính kháng oxy hóa pháp đo quang phổ UV-VIS ở 390 nm của tủa fucoidan (chưa qua tinh sạch và 430 nm, theo đường chuẩn y = bằng DEAE) được thể hiện tại Bảng 1. Bảng 1. Kết quả thử hoạt tính của Fucoidan trong rong sụn theo phương pháp DPPH, ABTS Nồng độ (µg/ml) Phương pháp DPPH Phương pháp ABTS 39.38 15.91 ± 1.61 14.92± 3.81 78.77 27.61 ± 3.44 29.49± 6.99 157.54 42.15 ± 1.81 43.75± 5.38 315.08 57.02 ± 1.49 58.42 ± 4.32 630.13 69.97 ± 1.12 70.05 ± 1.71 IC50 IC50=303.51± 1.65 (µg/ml) IC50=299.97+ 1.75(µg/ml) Xác định hoạt tính kháng khuẩn của Kết quả xác định vòng kháng khuẩn fucoidan từ rong sụn của dịch trích ly và sau tinh sạch 561
4. Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học fucoidan thể hiện qua Bảng 2. Bảng 2. Kết quả đường kính vòng kháng khuẩn của dịch trích ly và dịch sau tinh sạch fucoidan Nồng độ Đường kính vòng kháng Nồng Đường kính vòng kháng mẫu khuẩn (mm) độ mẫu khuẩn (mm) pha Dịch trích ly fucoidan pha Dịch fucoidan tinh sạch loãng loãng B.cereus E.coli B.cereus E.coli (µg/ml) (µg/ml) 350 - - 280 - - 450 1.67 5,17 380 2.83 6.83 550 5.83 6.17 480 7.17 8.17 650 8.00 9.33 580 9.00 10.50 Từ Bảng 2, đối với E.coli, dịch chiết thì nồng độ 580 µg/ml ức chế tốt fucoidan 650µg/ml cho đường kính Escherichia coli lẫn Bacillus cereus. vòng vô khuẩn lớn nhất (9.33mm). Đối Xác định thử hoạt tính kháng mốc với loài vi khuẩn Bacillus cereus ở Kết quả thử hoạt tính kháng mốc của nồng độ 650µg/ml, 550µg/ml, dịch trích ly và sau tinh sạch fucoidan 450µg/ml của dịch chiết sau 24 giờ thể hiện trong Bảng 3. Bảng 3 cho thấy khảo sát và hiệu lực tương tự nhau với dịch fucoidan tinh sạch được cô đặc có kết quả đường kính từ 1.67-8mm. Với khả năng ức chế sự phát triển của các các nồng độ 380µg/ml, 480µg/ml, loại nấm mốc Aspergillus niger và 580µg/ml sau 24 giờ khảo sát kết quả Aspergillus flavus. Nồng độ ức chế tối đường kính ghi nhận được trải dài từ thiểu và đường kính vòng kháng khuẩn 2.83-9mm. Bacillus subtilis không bị của hai loại nấm mốc lần lượt là 680 ức chế mạnh bởi các loại cao chiết hay μg/ml, 11.17 mm và 580 μg/ml, 9mm. dịch fucoidan tinh sạch so với Dịch fucoidan tinh sạch có hoạt tính Escherichia coli. Điều này thấy các vi cao hơn dịch trích ban đầu (đường kính khuẩn Gram âm khá nhạy cảm và dễ bị vòng kháng mốc) lớn hơn và dịch ảnh hưởng từ các hiệu ứng kháng fucoidan tinh sạch có nồng độ thấp hơn khuẩn hơn so với Gram dương. Như dịch trích ban đầu đã ức chế được sự vậy, với cao chiết thì nồng độ 650 phát triển của nấm mốc. µg/ml ức chế tốt, còn với dịch tinh sạch Bảng 3. Kết quả đường kính kháng nấm mốc của dịch fucoidan tinh sạch Đường kính vòng Đường kính vòng Nồng độ kháng nấm (mm) Nồng độ kháng nấm (mm) mẫu pha mẫu pha Dịch fucoidan tinh loãng Dịch trích ly fucoidan loãng sạch (µg/ml) (µg/ml) A.niger A.flavus A.niger A.flavus 350 - - 380 - - 450 - - 480 - - 550 - 6 580 - 9 650 10 10 680 11.17 12.83 562
5. Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học KẾT LUẬN tính kháng khuẩn (B. cereus, E. coli) và Các kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng, sắc kháng mốc (A. niger, A. flavus), đồng ký trao đổi ion có hiệu quả trong việc thời có khả năng chống oxy hóa. Như tinh sạch fucoidan từ rong sụn đồng vậy có thể thấy, rong sụn là một nguồn thời tổng hàm lượng fucoidan thu được nguyên liệu tiềm năng, giúp mở ra một sau tinh sạch khá cao. Ngoài ra dịch hướng đi mới trong việc ứng dụng vào fucoidan sau khi tinh sạch còn có hoạt thực phẩm chức năng. TÀI LIỆU THAM KHẢO K. MARXEN, K. H. VANSELOW, S. LIPPEMEIER, R. HINTZE, A. RUSER, AND U.P. HANSEN. Determination of DPPH radical oxidation caused by methanolic extracts of some microalgal species by linear regression analysis of spectrophotometric measurements. Sensors, vol. 7, no. 10, pp. 2080-2095, 2007. R. RE, N. PELLEGRINI, A. PROTEGGENTE, A. PANNALA, M. YANG, AND C. RICE-EVANS. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free radical biology and medicine, vol. 26, no. 9-10, pp. 1231-1237, 1999. S. P. KAMBLE, R. B. GAIKAR, R. B. PADALIA, AND K. D. SHINDE. Extraction and purification of C-phycocyanin from dry Spirulina powder and evaluating its antioxidant, anticoagulation and prevention of DNA damage activity. Journal of Applied Pharmaceutical Science, vol. 3, no. 8, p. 149, 2013. T. MARUDHUPANDI, T. A. KUMAR, S. L. SENTHIL, AND K. N. DEVI. In vitro antioxidant properties of fucoidan fractions from Sargassum tenerrimum. Pakistan Journal of Biological Sciences, vol. 17, no. 3, p. 402, 2014. 563