Phân lập và đặc điểm các chủng enterococcus feacalis trên cá chình hoa (anguila marmorata) nuôi tại Quảng Bình

Nội dung text: Phân lập và đặc điểm các chủng enterococcus feacalis trên cá chình hoa (anguila marmorata) nuôi tại Quảng Bình

1. TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 5(2)-2021:2467-2477 PHÂN LẬP VÀ ĐẶC ĐIỂM CÁC CHỦNG Enterococcus feacalis TRÊN CÁ CHÌNH HOA (Anguila marmorata) NUÔI TẠI QUẢNG BÌNH Nguyễn Ngọc Phước*, Nguyễn Thị Huế Linh, Nguyễn Đức Quỳnh Anh, Nguyễn Nam Quang, Nguyễn Thị Xuân Hồng Trường Đại học Nông Lâm, Đại học Huế *Tác giả liên hệ: nguyenngocphuoc@huaf.edu.vn Nhận bài: 09/05/2021 Hoàn thành phản biện: 27/05/2021 Chấp nhận bài: 01/06/2021 TÓM TẮT Enterococcus là một trong những tác nhân gây bệnh phổ biến trên cá nuôi trên thế giới. Nghiên cứu này đã phân lập được 10 chủng Enterococcus từ 10/15 mẫu cá chình có dấu hiệu bụng sưng to và xuất huyết ở xương nắp mang. Dấu hiệu bệnh tích cho thấy gan, thận, lách bị sưng to và xuất huyết. Tất cả các chủng Enterococcus được xác định là nhóm D bằng phản ứng ngưng kết kháng nguyên Lancefield. Các chủng này khá đồng nhất về mặt sinh hoá, đều là cầu khuẩn, Gram dương, không di động, cho phản ứng oxidase và catalase âm tính, không làm tan huyết trên môi trường thạch máu. Kết quả định danh bằng giải trình tự gen 16S rRNA cho thấy cả 10 chủng vi khuẩn phân lập được đều là Enterococcus faecalis. Nghiên cứu khả năng mẫn cảm kháng sinh cho kết quả cả 10 chủng đều kháng với ampicillin, tetracycline và oxytetracycline, trong khi đó các loại kháng sinh gentamycin, penicillin, erythromycin và ciprofloxacin đều nhạy với các chủng vi khuẩn này. Đây là nghiên cứu đầu tiên về phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh hoá của E. faecalis phân lập trên cá chình bị bệnh tại tỉnh Quảng Bình (nói riêng) và tại Việt Nam (nói chung). Từ khóa: Anguila marmorata, Cá chình hoa, Enterococcus feacalis, Kháng thuốc, Quảng Bình ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF THE Enterococcus faecalis STRAINS ISOLATED FROM GIANT MOLTED EEL (Anguila marmorata) IN QUANG BINH PROVINCE Nguyen Ngoc Phuoc*, Nguyen Thi Hue Linh, Nguyen Duc Quynh Anh, Nguyen Nam Quang, Nguyen Thi Xuan Hong University of Agriculture and Forestry, Hue University ABSTRACT Enterococcus is one of the major pathogens in farmed fish in the world. In this study, 10 isolates of Enterococus were recovered from 10 diseased eels showed the hemorrhagic traces in the operculum and swollen in body cavity. Internally, the kidney, liver and spleen were enlarged and hemorrhagic. All isolates of Enterococcus were identified as Group D by Lancefield test. Biological characteristics of isolates were homogeneous, consisting of cocci, non-motile, negative reaction with oxidase, catalase, and showed non-haemolytic in the blood agar. The morphological, biochemical, and sequencing analysis using the 16S rRNA universal gene of ten isolates from ten diseased eels resulted were Enterococcus faecalis. Antibiotics susceptibility test indicated that the isolates were resistant to ampicillin, tetracycline and oxytetracycline and sensitive to gentamycin, penicillin, erythromycin and ciprofloxacin. To our knowledge, this is the first study on isolation and characterization of the E. faecalis strain isolated from farmed eels in Quang Binh province particularly and Vietnam generally. Keywords: Anguilar marmorata, Giant molted eel, Antibiotic resistant, Enterococcus faecalis, Quang Binh 2467
2. HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol. 5(2)-2021: 2467-2477 1. MỞ ĐẦU phân bố rộng rãi trong đất, nước và thực vật. Cá chình hoa (Anguila marmorata) là Hiện nay, chi Enterococcus có hơn 50 loài loài cá có dinh dưỡng cao và rất có giá trị trong đó phổ biến nhất là Enterococcus kinh tế, là loại thực phẩm được ưa chuộng faecalis, sau đó là E. faecium, E. hirae, E. trên thị trường trong nước và quốc tế. Ở các durans, E. casseliflavus, E. tỉnh miền Trung Việt Nam, bên cạnh những gallinarum and E. mundti (Novais và cs., đối tượng nuôi chủ lực như tôm thẻ chân 2018). Enterococcus spp. gây bệnh trên cá trắng, tôm sú, thì cá chình hoa là đối tượng được phát hiện đầu tiên trên cá cam (Seriola nuôi nước ngọt có tiềm năng phát triển vì quinqueradiata) nuôi tại Nhật Bản (Kusuda giá trị kinh tế cao. Cá chình hoa được nuôi và Salati, 1993), trên cá bơn (Scophthalmus ở tỉnh Quảng Bình từ những năm 2005 và là maximus) (Nieto và cs., 1995) và trên cá rô đối tượng nuôi phổ biến hiện nay. Tuy phi (Oreochromis niloticus) (Plumb và nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu trên cá Hanson, 2010). E. faecalis đã được phát chình chủ yếu tập trung về phân bố, thành hiện là tác nhân gây bệnh trên cá rô phi ở Ai phần loài và rất ít nghiên cứu về bệnh trên Cập (Ahmed và El- Refaey., 2003; Emman cá chình đặc biệt là bệnh do vi khuẩn gây ra và cs., 2019), Thái Lan (Petersen và (Từ Thanh Dung và cs., 2014). Trong Dalsgaard, 2003), Banladesh (Rahman và những năm gần đây, tại Quảng Bình đã có cs., 2017), và Indonesia (Rizkiantino và cs., một số cá chình hoa chết với dấu hiệu bệnh 2020). Ngoài ra, Enterococcus còn được lý do vi khuẩn gây ra như bụng sưng to, phân lập từ môi trường nước xung quanh xoang bụng chứa nhiều dịch nhầy, xuất các ao nuôi thuỷ sản, cũng như trên động huyết ở các nội quan như gan, thận, lách . vật thuỷ sản bị nhiễm bệnh hay khoẻ mạnh (Araújo và cs., 2021). Tuy nhiên, chưa có Vi khuẩn được xem là tác nhân gây nghiên cứu nào về bệnh do vi khuẩn bệnh cho các loài cá nuôi nước mặn và nước E. faecalis trên động vật thuỷ sản nuôi tại ngọt trên toàn thế giới (Thurne và cs., 1993; Việt Nam. Austin và Austin, 2012), trong đó Aeromonas, Edwardsiella, Pseudomonas, Kháng sinh được dùng phổ biến trong điều trị bệnh do vi khuẩn gây ra trên động Flavobacterium, và Streptococus là những vật thuỷ sản, mặc dù việc sử dụng kháng chi vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở nhiều loài sinh tạo ra nhiều hiệu ứng không mong cá nước ngọt ở vùng nhiệt đới (Thurne và muốn như: gia tăng các chủng vi sinh vật cs., 1993). Bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá kháng kháng sinh, ô nhiễm môi trường nước có thể gây tỷ lệ chết lên đến 50% trong 3 và đất, ngoài ra tồn dư kháng sinh làm ảnh đến 5 ngày và ảnh hưởng nặng nề đến sản hưởng đến an toàn thực phẩm (Novais và lượng nuôi (Yanong và France-Floyd, cs., 2018). Hiện nay, chưa có nhiều thông 2002; Austin và Austin, 2012). Bên cạnh tin về khả năng mẫn cảm kháng sinh của đó, nhiều báo cáo cho thấy tác nhân vi E. faecalis phân lập từ cá nuôi tại Việt Nam. khuẩn cơ hội khác cũng đã gây dịch bệnh Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, nghiên trên nhiều loài cá nuôi khác nhau trong đó cứu này nhằm tìm hiểu đặc điểm sinh học có nhóm cầu khuẩn Gram dương của các chủng E. faecalis phân lập từ cá Enterococcus (Khafagy và cs., 2009; chình bị bệnh nuôi tại tỉnh Quảng Bình, và Rahman và cs., 2017; Rizkiantino và cs., đánh giá khả năng mẫn cảm kháng sinh của 2020). Enterococcus spp. là một thành phần các chủng E. faecalis phân lập được nhằm trong hệ vi sinh vật ở xoang miệng, hệ tiêu cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên hoá và hệ sinh dục ở người và động vật, 2468 Nguyễn Ngọc Phước và cs.
3. TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 5(2)-2021:2467-2477 cứu sâu hơn về tác nhân gây bệnh này và latex (khoảng 10 µL/giọt) nhỏ lên giấy thử làm tiền đề đưa ra các phương pháp phòng theo từng nhóm A, B, C, D, F, G. Dùng que và trị bệnh hiệu quả để phát triển nghề cấy tiệt trùng lấy khoảng từ 3-5 khuẩn lạc nuôi cá chình tại Việt Nam. cho vào 3 mL nước muối sinh lý, sau đó cho 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 100 µL dung dịch phân giải vào và ủ ở nhiệt độ 55 oC trong 10 phút ở nồi cách thủy, tiếp 2.1. Địa điểm thu mẫu theo nhỏ một giọt dung dịch vi khuẩn lên Mẫu cá bệnh được thu trực tiếp tại 3 các nhóm A, B, C, D, F và G tương ứng. hộ nuôi cá chình (QB1, QB2 và QB3) tại Dùng tăm tiệt trùng trộn đều 2 dung dịch. huyện Lệ Thuỷ, tỉnh Quảng Bình, mỗi hộ Phản ứng dương tính sẽ có ngưng kết xuất thu 5 con cá có dấu hiệu bệnh lý xuất huyết hiện trong 5 – 10 giây. Vi khuẩn lở loét ở vùng bụng, da cá tối sẫm, bơi lội Enterococcus cho phản ứng ngưng kết ở chậm, nổi đầu. Cá thu được đóng trong túi nhóm D, còn các loài vi khuẩn Streptococus o nilon 15 L có sục khí và vận chuyển ở 15 C cho phản ứng ngưng kết ở các nhóm còn lại. về phòng thí nghiệm Bệnh học thuỷ sản, 2.3.2. Phương pháp định danh vi khuẩn Khoa Thuỷ sản, trường Đại học Nông Lâm, bằng phương pháp giải trình tự gen 16S Đại học Huế để phân tích mẫu. Những mẫu rRNA cá bệnh này được quan sát các dấu hiệu DNA của các chủng vi khuẩn phân bệnh lý bên ngoài và dấu hiệu bệnh tích bên lập được trích ly bằng DNA preparation Kit trong cơ thể trước khi nuôi cấy và phân lập (SolGent, Korea), theo hướng dẫn của nhà vi khuẩn. sản xuất. Sử dụng cặp mồi 27F (5’- 2.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn từ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) và mẫu bệnh phẩm 1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT- Phân lập vi khuẩn được tiến hành 3’) để khuếch đại gen 16S rRNA ở máy bằng cách dùng dao mổ đã được tiệt trùng Thermal Cycler Dice® Gradient (Takara, bằng cồn 90o, mổ xoang bụng của cá, dùng Shiga, Nhật Bản) (Rizkiantino và cs., que cấy nhựa tiệt trùng đâm thẳng vào thận 2020). Hỗn hợp phản ứng PCR được tiến rồi cấy lên môi trường Tryptone Soya Agar hành gồm DNA của chủng vi khuẩn đã (TSA, HiMedia, Ấn Độ) đã được chuẩn bị được trích ly, 0.5 mM mỗi đoạn mồi, 1U sẵn. Dùng parafin bao kín lại và giữ ở nhiệt Taq polymerase (Takara, Shiga, Nhật Bản), o độ 28 C trong 48 giờ. Khuẩn lạc chiếm ưu 100 mM dNTPs, và 2.5 mM MgCl2. Các thế được cấy chuyền lên môi trường TSA và mẫu được xử lý nhiệt ở 95 °C trong 3 phút môi trường Brilliant Group B Streptococcus và sau đó được khuếch đại với 35 chu kỳ (GBS) agar (Oxoid, Anh), ủ ở nhiệt độ 28oC nhiệt gồm 95°C trong 30 giây, 50°C trong trong 48 giờ để tạo dòng thuần cho những 30 giây, và 72°C trong 60 giây; cuối cùng là nghiên cứu tiếp theo. 72oC trong 5 phút (Rizkiantino và cs., 2.3. Phương pháp định danh vi khuẩn 2020). Sản phẩm sau khi khuếch đại được 2.3.1. Phương pháp định danh vi khuẩn chạy điện di trên 1% agarose gel và DNA bằng phản ứng ngưng kết kháng nguyên được quan sát dưới đèn UV sau khi nhuộm ethidium bromide. Sản phẩm sau khi Kiểu huyết thanh được xác định bằng khuếch đại được tinh sạch bằng DNA clean phương pháp ngưng kết miễn dịch theo up system (Bioneer, Daejeon, Hàn Quốc) phương pháp Lancefield (Lancefield, 1933) theo hướng dẫn của nhà sản xuất, sau đó với bộ kit Strep-B-Latex (GBS) (Đan được giải trình tự nucleotide tại phòng thí Mạch). Đầu tiên lấy hai giọt dung dịch 2469
4. HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol. 5(2)-2021: 2467-2477 nghiệm Head Diagnositics institude 2.5. Phương pháp xác định sự mẫn cảm Manufacturing Center, Biochemical kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân Resarch Institute (Hàn Quốc). lập được So sánh sự giống nhau của gen 16S Sự mẫn cảm kháng sinh của vi khuẩn rRNA giữa các chủng vi khuẩn được thực được kiểm tra bằng phương pháp khuếch hiện bằng phần mềm Basic Local tán trên đĩa thạch theo phương pháp của Alignment Search Tool program (BLAST) Bauer và cs. (1966). Dùng que cấy tiệt trùng trên trang National Center for lấy khuẩn lạc trên đĩa vi khuẩn cho vào ống Biotechnology Information (NCBI). Trình nghiệm chứa 10 mL nước muối sinh lý tự các acid nucleic của gen 16S rRNA được (0,86% NaCl) đã tiệt trùng. Trộn đều và xác hiệu chỉnh bằng phần mềm Clustal W2 định mật độ vi khuẩn tương đương với dung editor trên trình duyệt dịch McFarland 0.5 (mật độ vi khuẩn 108 www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/. cfu.mL-1). Sau đó, lấy 100 L huyền phù vi Phân tích quan hệ gần gũi giữa các khuẩn cấy trên môi trường Mueller Hinton chủng phân lập được thực hiện bởi công cụ Agar (MHA, Himedia, Ấn độ), để khô PHYLIP theo Saitou và Nei (1987). Cây khoảng 10 phút, đặt các khoanh giấy có tẩm phả hệ được xác định bằng phần mền các loại kháng sinh ampicillin (10 μg), MEGA 7.0 (Kumar và cs., 2016; Tamura và oxytetracycline (30 μg), tetracycline (30 cs., 2013) xử lý bootstrap với 1000 lần lặp. μg), erythromycin (15 μg), gentamicin (10 2.4. Phương pháp xác định đặc điểm sinh μg), penicillin (10 μg), và ciprofloxacin (5 hoá μg) (Nam Khoa, Việt Nam) lên đĩa thạch, Các phản ứng cơ bản gồm có: nhuộm nuôi cấy ở nhiệt độ 28oC. Tiến hành đo đường Gram, oxidase, khả năng di động và phản kính vòng vô khuẩn sau 24 giờ. Đánh giá khả ứng catalase được tiến hành theo phương năng nhạy cảm hay kháng kháng sinh của vi pháp của Devriese và cs. (1993). Các phản khuẩn dựa trên dựa trên đường kính vòng vô ứng sinh hoá khác như phát triển trong môi khuẩn theo tiêu chuẩn của Clinical and trường TSB + 6.5% NaCl, khả năng dung Laboratory Standards Institute (CLSI, huyết trên môi trường thạch chứa 5% máu 2016). cừu được tiến hành trên môi trường thương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN mại của công ty Nam Khoa (Việt Nam). 3.1. Kết quả phân lập và định danh vi Đặc điểm sinh hoá của các chủng vi khuẩn khuẩn bằng kết quả ngưng kết kháng được xác định bằng API 20 Strep kit nguyên (BioM´erieux, Mỹ). Các tấm API 20 Strep Trong 15 mẫu cá chình hoa có biểu kit được bổ sung dung dịch vi khuẩn với hiện bơi lờ đờ, hoạt động chậm chạp, kém nồng độ 105 cfu/mL theo hướng dẫn của linh hoạt, da cá có màu tối sẫm, có 2 mẫu cá công ty và đọc kết quả sau 2 ngày nuôi cấy có dấu hiệu xuất huyết ở nắp mang (hình ở nhiệt độ 28oC. 1A). 10 mẫu cá có dấu hiệu gan và thận sưng to, ruột không có thức ăn (Hình 1 B). Xuất hiện hiện tượng xung huyết ở gan, thận và lách. Xoang bụng chứa nhiều dịch nhầy. 2470 Nguyễn Ngọc Phước và cs.
5. TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 5(2)-2021:2467-2477 Hình 1. Cá chình hoa có dấu hiệu xuất huyết ở xương nắp mang (vòng tròn, A), gan, thận sưng to và xung huyết (mũi tên, B) Từ 15 mẫu cá chình bị bệnh nuôi tại trắng sữa trên môi trường TSA (Hình 2A). các trại cá ở huyện Lệ Thuỷ, tỉnh Quảng Tất cả các chủng tạo khuẩn lạc màu xanh trên Bình khi nuôi cấy trên môi trường TSA đã môi trường Brilliant GBS Agar (Hình 2B). phân lập được 10 chủng vi khuẩn ở những cá Các chủng vi khuẩn đều có dạng hình cầu, có dấu hiệu xuất huyết ở nội quan. Tất cả các bắt màu tím khi nhuộm Gram, cho thấy đây chủng vi khuẩn phân lập được đều tạo ra 1 là những cầu khuẩn Gram dương. dạng khuẩn lạc thuần, có dạng tròn đều, màu Hình 2. Khuẩn lạc tròn, đều, màu trắng trên môi trường TSA (A), màu xanh trên môi trư ờng Brilliant GBS và vi khuẩn có dạng hình cầu, bắt màu tím của thuốc nhuộm Gram (C). Kết quả phân lập và định danh bằng chủng vi khuẩn từ thận của các mẫu cá ph ản ứng ngưng kết kháng nguyên của 10 chình bệnh được trình bày ở Bảng 1. Bảng 1. Kết quả định danh bằng phản ứng ngưng kết kháng nguyên của hệ thống phân nhóm Lancefield từ các mẫu cá bệnh tại Quảng Bình Hộ Mẫu thu Phân nhóm Lancefiled Kết quả định danh QB1001 Nhóm D Enterococcus QB1001 QB1002 Nhóm D Enterococcus QB1002 1 QB1003 Nhóm D Enterococcus QB1003 QB1004 Nhóm D Enterococcus QB1004 QB1005 Nhóm D Enterococcus QB1005 QB2001 Nhóm D Enterococcus QB2001 2 QB2002 Nhóm D Enterococcus QB2002 QB2003 Nhóm D Enterococcus QB2003 QB3001 Nhóm D Enterococcus QB3001 3 QB3002 Nhóm D Enterococcus QB3002 2471
6. HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol. 5(2)-2021: 2467-2477 Phản ứng ngưng kết kháng nguyên Các chủngvi khuẩn được định danh Lancefield là một hệ thống phân loại cầu bằng phương pháp phân tích gen mã hóa khuẩn Gram dương, catalase âm tính dựa 16S – rRNA, kết quả mã hoá trình tự axít trên thành phần carbohydrate của kháng nucleic và phân tích trên phần mềm BLAST nguyên vi khuẩn được tìm thấy trên thành tế được trình bày ở Hình 3. bào của chúng. Kết quả cho thấy có 10/10 Kết quả cho thấy: 10/10 chủng vi chủng vi khuẩn (chiếm 100%) cho phản ứng khuẩn phân lập trên cá chình hoa có trình tự ngưng kết kháng nguyên ở nhóm D, từ đó nucleotide giống đến 100% so với đoạn gen 10 chủng này thuộc chi cầu khuẩn 16S rRNA của chủng Enterococcus faecalis Enterococcus, nhưng chưa định danh được LN554942. Từ kết quả trên cho phép kết đến loài. luận 10 chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu cá 3.2. Kết quả định danh bằng phương chình nuôi tại Quảng Bỉnh là Enterococcus pháp giải trình tự gen 16S-rRNA faecalis. Hình 3. Cây phát sinh loài được xây dựng dựa trên trình tự một phần của gen 16S rRNA của 10 chủng vi khuẩn phân lập được và vùng tương ứng ở đoạn gen 16S rRNA của chủng Enterococcus faecalis LN554942. Các số ở các nhánh biểu thị tỷ lệ phần trăm trùng khớp. Tỷ lệ ở phía dưới biểu thị khoảng cách tiến hóa của các nucleotide thay thế trên mỗi vị trí. Vi khuẩn E. faecalis là nhóm cầu Novais và cs., 2018; Rizkiantino và cs., khuẩn Gram dương, sống phổ biến trong hệ 2020). Các yếu tố môi trường như nhiệt độ thống tiêu hoá ở người, trước đây được phân ảnh hưởng rất lớn đến khả năng gây bệnh loại là Streptococcus nhóm D, và cũng là cuả nhóm liên cầu khuẩn trên cá loài gây bệnh trên cá nuôi trên thế giới (Rizkiantino và cs., 2020; Phuoc và cs., (Nieto và cs., 1995; Rahman và cs., 2017; 2021) và gần đây E. faecalis được xem là 2472 Nguyễn Ngọc Phước và cs.
7. TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 5(2)-2021:2467-2477 tác nhân gây bệnh phổ biến trên cá nuôi Đặc điểm sinh hoá của 10 chủng E. nhiệt đới (Rahman và cs., 2017; Rizkiantino faecalis phân lập được trên cá chình tại tỉnh và cs., 2020). Tuy nhiên chưa có nghiên cứu Quảng Bình khá đồng nhất về mặt sinh hoá nào phân lập E. faecalis trên cá nuôi tại Việt (Bảng 2). Tất cả các chủng đều cho phản Nam. Nghiên cứu này là nghiên cứu đầu ứng oxidase và catalase âm tính, đều phát tiên phân lập được E. faecalis từ những mẫu triển được trên môi trường TSB có bổ sung cá chình bị bệnh nuôi tại tỉnh Quảng Bình 6.5% NaCl. Tất cả các chủng đều là cầu nói riêng và tại Việt Nam nói chung, các khuẩn, không tan huyết trên thạch máu cừu nghiên cứu trước đây về liên cầu khuẩn gây và không di dộng. Tất cả các chủng đều bệnh trên cá nuôi nước ngọt tại Việt Nam kháng với polymixin và optochin và đều có chỉ báo cáo về vi khuẩn Streptococcus khả năng lên men với các loại đường như (Đổng Thanh Hà và cs., 2013; Phạm Hồng D-sorbitol, D-ribose, D-maltose, D-manose Quân và cs., 2013; Nguyễn Ngọc Phước và và D-trehalose (Bảng 2). Đặc điểm sinh hoá cs., 2015). Sự phát hiện này cung cấp cơ sở của các chủng E. faecalis trong nghiên cứu khoa học cho việc nghiên cứu sâu hơn về E. này giống với đặc điểm sinh hoá của các faecalis gây bệnh trên cá nuôi tại Việt Nam. chủng E. faecalis gây bệnh trên cá rô phi 3.3. Một số đặc điểm sinh hoá của các nuôi tại Malaysia (Rahman và cs., 2017) và chủng vi khuẩn Enterococcus faecalis Indonesia (Rizkiantino và cs., 2020). Bảng 2. Đặc điểm sinh hoá của các chủng Enterococcus faecalis Tỷ lệ % của 10 chủng vi khuẩn phân lập Chỉ tiêu Dương tính Âm tính Nhuộm Gram 100 0 Hình thái Hình cầu Di động Không Khả năng tan huyết 100 () Oxidase 100 Catalase 100 D-Amygdalin 100 Phosphatidylinositol Phospholipase C 100 D-Xylose 100 Beta-Galactosidase 100 Arginine Dihydrolase 1 100 Alpha-Glucosidase 100 Ala-Phe-Pro Arylamidase 100 L-Proline Arylamidase 100 Polymixin B Resistance 100 D-Sorbitol 100 0 Lactose 100 D-Ribose 100 D-Maltose 100 D-Trehalose 100 D-Rafinose 100 D-Manitol 100 0 D-Manose 100 0 Salicin 100 Optochine Resistance 100 Urease 10 90 TSB 6.5% NaCl 100 2473
8. HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol. 5(2)-2021: 2467-2477 3.4. Khả năng nhạy cảm kháng sinh của mức độ sử dụng một loại kháng sinh cao sẽ các chủng vi khuẩn Enterococcus faecalis làm gia tăng tình trạng kháng kháng sinh đó. Kết quả thử khả năng nhạy cảm Kết quả nghiên cứu này phù hợp với kết quả kháng sinh cho thấy gentamycin, penicillin, của Osman và cs. (2017) khi nghiên cứu khả erythromycin và ciprofloxacin nhạy với các năng kháng kháng sinh của vi khuẩn chủng E. faecalis (Hình 3, Bảng 3), cho thấy Enterococcus gây bệnh trên cá rô phi 4 loại kháng sinh này là những loại ít sử (Oreochromis niloticus) nuôi tại Ai Cập. dụng trong nuôi cá chình tại tỉnh Quảng Trong nghiên cứu này, 100% chủng kháng Bình, trong đó ciprofloxacin không được với tetracycline, 17% chủng kháng phép sử dụng trong nuôi trồng thuỷ sản. ciprofloxacin và tất cả các chủng đều nhạy Ngược lại, cả 10 chủng E. faecalis phân lập với penicillin và gentamycin. Tuy nhiên, được đều kháng với tetracycline và các chủng E. faecalis khi phân lập trên cá rô oxytetracycline, 80% số chủng kháng với phi nuôi tại Indonesia và Maylaysia thì đều ampicillin (Bảng 3). Kết quả này cho thấy 3 kháng với ampicillin và penicillin loại kháng sinh tetracycline, (Rizkiantino và cs., 2020; Rahman và cs., oxytetracycline và ampicillin được sử dụng 2017). Khi nghiên cứu về khả năng kháng phổ biến trong nuôi trồng thuỷ sản tại tỉnh kháng sinh của nhóm liên cầu khuẩn gây Quảng Bình. Điều này phù hợp với kết quả bệnh trên cá rô phi nuôi tại Thừa Thiên Huế, của Rizkiantino và cs. (2020) khi nghiên Nguyễn Ngọc Phước và cs. (2019) cũng cứu mối tương quan giữa việc sử dụng phát hiện hơn 60% chủng Streptococcus kháng sinh và tỷ lệ kháng thuốc cho thấy kháng với tetracyline và amplicilin và 100% chủng nhạy với penicilin. Bảng 3. Sự mẫn cảm đối với 7 loại kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được Đường kính vòng vô khuẩn (mm) và tỷ lệ % của 10 chủng Loại kháng sinh Enterococcus faecalis (Giá trị trung bình Độ lệch chuẩn) Nhạy cảm Kháng Gentamycin (10 μg) 10 0,5 (100%) 0 Ampicillin (10 μg) 17 0.00 (20%) 10 0,5 (80%) Tetracycline (30 μg) 0 20 0,5 (100%) Penicillin (10 μg) 15,5 0,5 (100%) 0 Ciprofloxacin (5 μg) 21 1,00 (90%) 13 0,5 (10%) Oxytetracycline (30 μg) 0 22,5 0.5 (100%) Erythromycin (15 μg) 24 0,50 (100%) 0 2474 Nguyễn Ngọc Phước và cs.
9. TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 5(2)-2021:2467-2477 Hình 3. Đường kính vòng vô khuẩn của một số loại kháng sinh A: ampicillin, OTC: oxytetracycline, T: tetracycline, P: penicillin, Cip: ciprofloxacin 4. KẾT LUẬN phân lập được trên cá chình nói riêng và cá Nghiên cứu đã phân lập được 10 nuôi tại Việt Nam nói chung. chủng Enterococcus trên 15 mẫu cá chình TÀI LIỆU THAM KHẢO nuôi tại tỉnh Quảng Bình. Các chủng này 1. Tài liệu tiếng Việt Đồng Thanh Hà, Nguyễn Viết Khuê và Nguyễn đều là cầu khuẩn Gram dương, không di Thị Hạnh. (2010). Một số đặc điểm của động và cho phản ứng oxidase và catalase Streptococcus agalactiae, tác nhân gây bệnh âm tính. Các chủng phân lập được tạo khuẩn Streptococcosis trên cá rô phi ở miền Bắc lạc hình tròn, màu trắng trên môi trường Việt Nam. Báo cáo khoa học - Trung tâm TSA và màu xanh trên môi trường Brilliant nghiên cứu quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản miền Bắc GBS agar, tạo phản ứng ngưng kết – Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy Sản I. Lancefield nhóm D. Kết quả định danh cho Nguyễn Ngọc Phước, Lưu Thị Ngọc Hạnh, thấy 10/10 chủng vi khuẩn Enterococcus là Nguyễn Thị Sao, Nguyễn Đức Quỳnh Anh, E. faecalis với đặc điểm sinh hoá khá đồng Trương Thị Hoa và Lê Văn Bảo Duy. nhất. Các chủng E. faecalis phân lập được (2015). Nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa vi khuẩn Streptococus spp. gây bệnh trên cá chình nuôi tại Quảng Bình nhạy cảm trên cá rô phi nuôi tại đồng bằng sông Cứu với các loại kháng sinh gentamycin, Long, Việt Nam. Tạp chí Khoa học – Đại penicillin, erythromycin và ciprofloxacin. học Huế, 104(05), 207-219. Đây là nghiên cứu đầu tiên về E. faecalis Nguyễn Ngọc Phước, Trần Thị Nhật Anh, Nguyễn Thị Huế Linh. (2019). Phân lập và 2475
10. HUAF JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCE & TECHNOLOGY ISSN 2588-1256 Vol. 5(2)-2021: 2467-2477 xác định một số đặc điểm sinh học các chủng Experimental pathogenesis and host immune Streptococcus agalactiae gây bệnh trên cá rô responses of Enterococcus faecalis infection phi đỏ (Oreochromis sp.) nuôi tại Thừa in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Thiên Huế. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Aquaculture, 521, 734319. Nông nghiệp, trường Đại học Nông Lâm, Khafagy, A. A. R., Eid, H. M. I., Abou El- Atta, Đại học Huế, 3(3), 1591-1601. M. E. I., & El-Fattah, L. S. (2009). Isolation Phạm Hồng Quân, Hồ Thu Thuỷ, Nguyễn Hữu of Enterococcus faecalis from tilapia in lake Vũ, Huỳnh Mỹ Lệ và Lê Văn Khoa. (2013). Temsah in Ismailia Governorate. SCVMJ, Một số đặc tính sinh học của vi khuẩn 14(2), 45-54. Streptococcus spp. gây bệnh xuất huyết ở cá Kumar, S., Stecher, G., & Tamura, K. (2016). rô phi nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Nam. Tạp chí khoa học và phát triển, 11(4), Analysis version 7.0 for bigger 506 - 513. datasets. Molecular Biology and Evolution, Từ Thanh Dung, Lý Văn Khánh, Trần Ngọc Hải msw054. (2014). Xác dịnh một số mầm bệnh trên cá Kusuda, R., & Salati, F. (1993). Major bacterial chình bông (Anguilla marmorata) nuôi trong diseases affecting mariculture in bể. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Japan. Annual Review of Fish Diseases, 3, Thơ. Số chuyên đề: Thủy sản 2, 177-183. 69-85. 2. Tài liệu tiếng nước ngoài Lancefield, R. C. (1933). A serological Ahmed, M. E, & El-Refaey. (2013). Studies on diferentatiation of human and other groups major bacterial diseases affecting fish; of hemolytic Streotococci. Journal of Tilapia Oreochromis niloticus, Catfish, Experimental Medicine, 57(4), 571-595. Clarias gariepinus and mullets in Port Said, Nieto, J., Devesa, S., Quiroga, I., & Toranzo, A. Egypt with special references to its (1995). Pathology of Enterococcus sp. pathological alterations. Researcher, 5, 5- infection in farmed turbot, Scophthalmus 14. maximus L. Journal of Fish Diseases, 18, Araújo, A. J. G., Grassotti, T. T & Frazzon, A. 21-30. P. G. (2021). Characterization of Novais, C., Campos, J., Freitas, A.R., Barros, Enterococcus spp. isolated from a fish M., Silveira, E., Coque, T.M., Antunes, P., farming environment in southern Brazil. & Peixex, L. (2018). Water supply and feed Brazilian Journal of Biology, 81(4), 954- as sources of antimicrobial- 961. resistant Enterococcus spp. in aquacultures Austin, B., & Austin, D.A. (2012). Bacterial of rainbow trout (Oncorhyncus mykiss), Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Portugal. The Science of the Total Fish. 5th ed. London, The United Kingdom: Environment, 625,1102-1112. Springer Science and Business Media Osman, K. M., Al-Maary, K. S., Mubarak, A. S., Dordrecht. Dawoud, T.M., Moussa, I. M. I., Ibrahim, M. Bauer, A. W., Kirby., W. M., & Sherris, J. C. D. S., Hessain, A. M., Orabi, A., & Fawzy, (1966). Antibiotic susceptibility testing by a N. M. (2017). Characterisation and standardized single disk method. American susceptibility of streptococci and Journal of Clinical Pathology, 45, 493- 496. enterococci isolated from Nile tilapia Clinical and Laboratory Standards Institute (Oreochromis nicotilus) showing (CLSI). (2016). Performance Standards for septicaemia in aquaculture and wild sites in Antimicrobial Susceptibility Testing. USA Egypt. BMC Veterinary Research, 13(1), (Pennsylvania): Clinical and Laboratory 357. Standards Institute. Petersen, A., & Dalsgaard, A. (2003). Devriese, L. A., Pot, B., & Collins, M. D. Antimicrobial resistance of intestinal (1993). Phenotypic identification of the Aeromonas spp. and Enterococcus spp. in genus Enterococcus and differentiation of fish cultured in integrated broiler-fish farms phylogenetically distinct enterococcal in Thailand. Aquaculture, 219, 71-82. species and species groups. Journal of Phuoc, N., N., Linh, N.T H., Crestani, C., & Applied Bacteriology, 75, 399-408. Ruth N. Zadoks, R. N. (2021). Effect of Eman, Z., Ahmed, M. H, Abdelhamid, F., strain and enviromental conditions on the Sadeyen, J. R, & Risha, E. (2019). virulence of Streptococcus agalactiae 2476 Nguyễn Ngọc Phước và cs.
11. TẠP CHÍ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ NÔNG NGHIỆP ISSN 2588-1256 Tập 5(2)-2021:2467-2477 (Group B Streptococcus; GBS) in red tilapia Journal of Survey in Fisheries Sciences, (Oreochromis sp.). Aquaculture, 534, 7(1), 27-42. 736256 Saitou, N., & Nei, M. (1987). The neighbor- Plumb, J., & Hanson, L. (2010). Health joining method: a new method for Maintenance and Principal Microbial reconstructing phylogenetic Diseases of Cultured Fishes, 3rd. John Wiley trees. Molecular Biology and Evolution, & Sons. 4(4), 406-425. Rahman, M., Deb, S. C., Alam, M.S., Alam, M. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, J., & Islam, M.T. (2017). Molecular A., & Kumar, S. (2013). MEGA6: Molecular identification of multiple antibiotic resistant Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0. fish pathogenic Enterococcus faecalis and Molecular Biology and Evolution, 30(12), their control by medicinal herbs. Nature: 2725-2729. Scientific Reports, 7, 3747. Thune, R. L., Stanley, L. A., & Cooper, R. K. Rizkiantino, R., Wibawan, I. W. T., Pasaribu, F. (1993). Pathogenesis of gram-negative H., Soejoedono, R. D., Arnafia, W., Ulyama, bacterial infections in warmwater fish. V., & Wibowo, D. B. (2020). Isolation and Annual Review of Fish Diseases, 3, 37 - 68. characterisation of the Enterococcus faecalis Yanong, R. P. E., & Francis-Floyd, R. (2002). strain isolated from red tilapia (Oreochromis Streptococcal Infections of Fish. hybrid) in Indonesia: A preliminary report. Cited 04 Apr 2021. 2477