Phân lập và khảo sát hoạt tính xâm nhiễm vi khuẩn aeromonas hydrophila của thực khuẩn thể từ các ao nuôi cá tra ở Tiền Giang

Nội dung text: Phân lập và khảo sát hoạt tính xâm nhiễm vi khuẩn aeromonas hydrophila của thực khuẩn thể từ các ao nuôi cá tra ở Tiền Giang

1. Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH XÂM NHIỄM VI KHUẨN AEROMONAS HYDROPHILA CỦA THỰC KHUẨN THỂ TỪ CÁC AO NUÔI CÁ TRA Ở TIỀN GIANG Lê Bửu Kỳ*, Bùi Thế Huy Trường Đại học Tiền Giang *Tác giả liên lạc: lebuuky1006@gmail.com TÓM TẮT Cá tra là một trong những đối tượng thủy sản xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Tuy nhiên, dịch bệnh và tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Aeromonas hydrophila đang là thách thức với ngành công nghiệp nuôi cá tra xuất khẩu. Với mục tiêu phân lập, tuyển chọn và khảo sát đặc điểm sinh học của các dòng thực khuẩn thể làm tiền đề cho những nghiên cứu ứng dụng để kiểm soát bệnh xuất huyết trên cá tra gây ra do A. hyrophila, 26 dòng thực khuẩn thể đã được phân lập bằng phương pháp Plaque Assay từ 100 mẫu nước ao nuôi cá ở tỉnh Tiền Giang. Ba thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG, pAh19.1TG được tuyển chọn thông qua kết quả về phần trăm thực khuẩn thể không xâm nhiễm lần lượt 44,4%, 58,5% và 52,9% và chu kỳ xâm nhiễm được xác định là 15 phút. Phổ xâm nhiễm đối với 36 chủng vi khuẩn A. hydrophila của 3 dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG, pAh19.1TG dao động từ 77,2% đến 80,6%. Cả 3 dòng thực khuẩn thể trên đều thuộc họ Myoviridae và có tính đặc hiệu cao khi không xâm nhiễm các vi khuẩn gây bệnh trên thủy sản và vi khuẩn Probiotics được khảo sát. Từ khóa: Aeromonas hydrophila, bacteriophages, kháng kháng sinh. ISOLATION AND CHARACTERIZATIONS OF BACTERIOPHAGES INFECTED AEROMONAS HYDROPHILA FROM TIEN GIANG PROVINCE VIETNAM Le Buu Ky*, Bui The Huy Tien Giang University *Corresponding Author: lebuuky1006@gmail.com ABSTRACT Catfish (Pangasianodon hypophthalmus) is one of the most exported products of Vietnam. Nonetheless, the epidemic and the antibiotic resistance status of Aeromonas hydrophila are a challenge for the catfish industry. The aim of this study was isolation, selection and investigation of the biological characteristics of the bacteriophages as the basis for applied research to control hemorrhage disease caused by A. hyrophila. The results showed 26 strains of bacteriophage was isolated by Plaque Assay Methodology from 100 catfish ponds in Tien Giang Province. Three phages including pAh17.5TG, pAh18.1TG, pAh19.1TG were selected via the un-absorption rate for 44.4%, 58.5% and 52.9% respectively. The time of lytic cycle was determined to be 15 minutes. Host range with 36 A. hydrophila strains of pAh17.5TG, pAh18.1TG, pAh19.1TG ranged from 77.2% to 80.6%. All three strains belong to the Myoviridae Family and have high specific due to not infect the other aquatic pathogens and probiotics bacteria. Keywords: Aeromonas hydrophila, antibiotic resistance, bacteriophages. 126
2. Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học TỔNG QUAN Bách Khoa, Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Trong những năm gần đây ngành công Minh. Chủng Lactobacillus fermentum nghiệp nuôi cá tra (Pangasianodon VTCCB-1051, Lactobacillus plantarum hypophthalmus) xuất khẩu đang phát VTCCB-890 được cung cấp bởi Viện triển mạnh và đã đưa cá tra trở thành sản Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa phẩm thủy sản xuất khẩu chủ lực của học và Công nghệ Việt Nam. Vi khuẩn nước ta. Tuy nhiên, dịch bệnh trên cá tra Vibrio parahaemolyticus, Vibrio nuôi xảy ra ngày càng nhiều và khó kiểm campellii, E. ictaluri được cung cấp bới soát. Theo khảo sát của Từ Thanh Dung Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. và ctv. (2012), các bệnh gan thận mủ do Vi khuẩn Lactobacillus acidilactici được vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, bệnh trắng cung cấp bởi Viện nghiên cứu Ứng dụng đuôi do Flavobacterium columnare và Công nghệ TP.HCM. Vi khuẩn bệnh xuất huyết do A. hydrophila gây ra Aeromonas veronii, Flavobacterium thường xuất hiện trong quá trình nuôi cá columnare được cung cấp bởi Trường tra thương phẩm. Hiện nay, việc phòng và Đại học Chulalongkorn, Thái Lan. Mẫu điều trị bệnh trên cá tra chủ yếu vẫn phụ nước dùng để phân lập thực khuẩn thể thuộc vào các loại thuốc kháng sinh và được thu nhận tại các ao nuôi cá tra thuộc hóa chất. Người sử dụng thuốc kháng Công ty Cổ phần Long An ở Huyện Cai sinh không đúng cách và không đúng quy Lậy và Công ty TNHH Phước Hòa ở định là nguyên nhân gây ra hiện tượng vi Huyện Tân Phước tỉnh Tiền Giang. khuẩn kháng kháng sinh và dư lượng Phương pháp nghiên cứu kháng sinh trong cá tra thành phẩm. Phương pháp thu mẫu: mẫu nước ao nuôi Trước thực trạng đó, đòi hỏi phải nhanh được thu cách mặt nước 30 cm ở 4 góc và chóng tìm ra các giải pháp hạn chế hoặc ở giữa của ao nuôi cá tra, mỗi góc cách bờ thay thế việc sử dụng chất kháng sinh. khoảng 2 m, bảo quản trong thùng đá, Liệu pháp thực khuẩn thể trong phòng và phân tích trong 24 giờ. Phân lập thực trị bệnh cho cá là một xu hướng mới có khuẩn thể, khảo sát đặc điểm vòng sinh nhiều triển vọng được các trung tâm khoa tan, hoạt tính xâm nhiễm bằng dược thực học trên thế giới tập trung nghiên cứu và hiện bằng kỹ thuật Plaque Assay (Jin phát triển. Để có những hiểu biết cụ thể Woo Jun et al., 2014). Phổ xâm nhiễm và hơn về thực khuẩn thể có khả năng xâm tính đặc hiệu được thực hiện bằng phương nhiễm vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên pháp Plaque Drop Assay (Oda et al., cá tra nuôi công nghiệp và những đặc tính 2004; Namura et al., 2008). Đặc điểm sinh học của thực khuẩn thể này, nghiên hình thái được xác định thông qua kính cứu được thực hiện với mục tiêu đóng hiển vi điện tử truyền qua TEM, thực góp nghiên cứu nền tảng tại Việt Nam khuẩn thể được phân loại theo Tổ chức nhằm ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể phân loại Virus quốc tế ICTV và để kiểm soát bệnh do A. hydrophila gây Ackerman et al. (2007). ra trên động vật thủy sản nói chung và cá tra nói riêng. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả phân lập thực khuẩn thể có VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP khả năng xâm nhiễm vi khuẩn A. NGHIÊN CỨU hydrophila bằng phương pháp Plaque Vật liệu Assay Vi khuẩn A. hydrophila M, Bacillus Tại 2 huyện Cai Lậy và Tân Phước thu subtilis natto, được cung cấp từ Đại học được 100 mẫu nước ao nuôi. Trong đó 30 127
3. Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học mẫu nước thu từ ao cá thương phẩm nuôi lượng thực khuẩn thể không xâm nhiễm, thâm canh quy mô công nghiệp và 70 xác định chu kỳ xâm nhiễm của 3 dòng mẫu thu tại các ao sản xuất cá giống nuôi thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG quy mô công nghiệp. Kết quả từ 100 mẫu và pAh19.1TG này là 15 phút. Chu kỳ nước phân lập bằng kỹ thuật Plaque xâm nhiễm của các dòng thực khuẩn thể Assay thu được 26 dòng thực khuẩn thể phân lập tại Tiền Giang tương đương với có khả năng xâm nhiễm A. hydrophila M chu kỳ trong nghiên cứu của Jian-Bin tương đương với tỷ lệ 26%. Các dòng Wang et al. (2016) và ngắn hơn chu kỳ 30 thực khuẩn thể sau khi phân lập bằng kỹ phút của Jin Woo Jun et al. (2013). thuật Plaque Assay sẽ được tiến hành Kết quả thí nghiệm khảo sát phổ xâm sàng lọc dựa vào độ mờ, rõ của vòng sinh nhiễm của các dòng thực khuẩn thể tan và đường kính vòng sinh tan. Các Các dòng thực khuẩn thể sau khi được dòng thực khuẩn thể cho vòng sinh tan rõ phân lập và tuyển chọn ở Tiền Giang sẽ có kích thước đường kính vòng sinh tan được tiến hành thử phổ xâm nhiễm với 36 lớn hơn 1mm, ngược lại các dòng thực chủng vi khuẩn A. hydrophila được phân khuẩn thể có vòng sinh tan mờ có kích lập và định danh ở các vùng khác nhau tại thước nhỏ hơn 1mm. Các dòng thực Tiền Giang và Bến Tre từ bộ sưu tập khuẩn thể ở vị trí TG17.5, TG18.1 và giống của Đại học Tiền Giang. TG19.1 có kích thước vòng sinh tan lớn Kết quả thí nghiệm cho thấy: phổ xâm nhất tương ứng với 1,28±0,02 mm, nhiễm của 3 dòng thực khuẩn thể 1,26±0,06 mm, 1,28±0,08 mm, khác biệt pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG không có ý nghĩa về mặt thống kê với trên 36 chủng vi khuẩn A. hydrophila nhau nhưng khác biệt có ý nghĩa về mặt phân lập được dao động từ 72,2% đến thống kê với 23 dòng thực khuẩn thể còn 80,6%. Trong đó dòng thực khuẩn thể lại. pAh19.1TG có phổ xâm nhiễm rộng nhất Từ thí nghiệm phần trăm thực khuẩn thể là 80,6%. Khi so sánh với kết quả phổ không xâm nhiễm cho kết quả 3 dòng xâm nhiễm của Jin Woo Jun et al. thì kết thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG quả của 3 dòng thực khuẩn thể phân lập ở và pAh19.1TG có phần trăm không xâm Tiền Giang có kết quả hẹp hơn. Tuy nhiễm ở thời điểm 15 phút lần lượt là nhiên, khi so sánh với kết quả của nhóm 44,2%, 58,5% và 52,9%, khác biệt không tác giả Jian-Bin Wang et al. vào năm có ý nghĩa về mặt thống kê với nhau. Khi 2016, phổ xâm nhiễm của các dòng thực so sánh kết quả nghiên cứu này với các khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG và công trình đã được công bố bởi các nhóm pAh19.1TG rộng hơn. tác giả Taruna Anand et al. (2015) cho Dựa vào kết quả phần trăm tỷ lệ xâm thấy: phần trăm thực khuẩn thể không nhiễm của thực khuẩn thể đối với vi xâm nhiễm của pAh17.5TG (44,2%) và khuẩn A. hydrophila thấy rằng khi tiến pAh19.1TG (52,9%) là thấp hơn. Đồng hành tổ hợp các dòng thực khuẩn thể với thời phần trăm không xâm nhiễm của nhau thành từng cặp như sau pAh17.5TG dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG cũng và pAh18.1TG, pAh17.5TG và thấp hơn so với kết quả 51% khi nhóm tác pAh19.1TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG giả El Araby et al. (2016). thì cho kết quả phổ xâm nhiễm lần lượt là Ở thời điểm 30 phút, nồng độ của 3 dòng 77,8%, 80,6% và 80,6%. Khi tổ hợp cả 3 thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG dòng thực khuẩn thể trên với nhau thì cho và pAh19.1TG tăng đột biến với tỷ lệ kết quả phổ xâm nhiễm là 80,6%. Từ kết phần trăm lần lượt là 123,7%, 79,8% và quả trên, có thể sử dụng riêng lẻ thực 409,9%. Từ các thời điểm khảo sát và số khuẩn thể pAh19.1TG, tổ hợp của dùng 128
4. Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học thực khuẩn thể này với một trong hai đối với các dòng vi khuẩn gây bệnh điển dòng thực khuẩn thể còn lại hoặc cả ba hình trong nuôi trồng thủy sản và vi dòng thực khuẩn thể. Tuy nhiên, để mở khuẩn có đặc tính probiotics cho thấy: tất rộng nghiên cứu phổ xâm nhiễm đối với cả các dòng thực khuẩn thể đều không các vi khuẩn A. hydrophila phân lập trên xâm nhiễm. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu các đối tượng thủy sản và các vùng nuôi của các dòng thực khuẩn thể được phân thủy sản khác ở Đồng bằng Sông Cửu lập ở Tiền Giang thì tương đồng với kết Long, tổ hợp 3 dòng thực khuẩn thể quả của Jin Woo Jun et al. vào năm 2013 pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG và Jian-Bin Wang et al. vào năm 2017. Từ sẽ được đề xuất lựa chọn làm nguyên liệu kết quả này có thể kết luận các dòng thực cho các nghiên cứu tiếp theo. khuẩn thể đã phân lập và tuyển chọn bao Kết quả phân loại các dòng thực khuẩn gồm pAh17.5TG, pAh18.1TG và theo ICTV dựa vào kết quả chụp TEM pAh19.1TG có tính đặc hiệu cao đối với Dựa vào kết quả ảnh chụp TEM của 3 vi khuẩn A. hydrophia. dòng thực khuẩn thể được phân lập từ các ao nuôi cá tra ở Tiền Giang, tiến hành ghi KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ nhận kích thước đầu, cổ và đuôi. Kết hợp Kết luận với các tiêu chuẩn phân loại theo họ thực Sau quá trình tuyển chọn 26 dòng thực khuẩn thể của ICTV. khuẩn thể phân lập từ 100 mẫu nước ở 20 Từ kết quả ảnh chụp TEM của 3 dòng ao nuôi cá tra ở Tiền Giang cho kết quả thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG ba dòng thực khuẩn thể được đặt tên là và pAh19.1TG cho thấy cả 3 dòng thực pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG khuẩn thể trên đều có cùng một loại cấu có vòng sinh tan rõ, đường kính vòng sinh trúc cơ thể bao gồm đầu, cổ và đuôi. Từ tan lớn nhất lần lượt là 1,28±0,02 mm, cấu trúc cơ thể trên có thể xếp các dòng 1,26±0,06 mm, 1,28±0,08 mm. Chu kỳ thực khuẩn thể thể pAh17.5TG, xâm nhiễm của 3 dòng thực khuẩn thể pAh18.1TG và pAh19.1TG vào họ pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG Myoviridae. Kết quả phân loại của 3 dòng là 15 phút, phần trăm thực khuẩn thể thực khuẩn thể phân lập được ở tỉnh Tiền không xâm nhiễm lần lượt là 44,2%, Giang trong nghiên cứu này cũng tương 58,5% và 52,9%, phổ xâm nhiễm rộng đồng với công bố của nhóm tác giả dao động từ 72,2% đến 80,6%. Trong đó, Taruna Anand et al. (2015). dòng thực khuẩn thể pAh19.1TG có phổ Kết quả thí nghiệm khảo sát tính đặc xâm nhiễm rộng nhất. Cả 3 dòng hiệu của các dòng thực khuẩn thể pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG Tiến hành khảo sát tính đặc hiệu của các đều thuộc họ Myoviridae dựa và kết quả dòng thực khuẩn thể được phân lập và ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử truyền tuyển chọn trước đó trên các chủng vi qua TEM và có độ đặc hiệu cao với vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản A. khuẩn A. hydrophila khi không xâm veronii, E. ictaluri, F. columnare, V. nhiễm một số chủng vi khuẩn gây bệnh parahaemolyticus, V. campellii, và các thường gặp trên thủy sản và các chủng vi chủng vi khuẩn có đặc tính probiotics khuẩn Probiotics. đang được ứng dụng trong nuôi trồng Kiến nghị thủy sản bao gồm: L. fermentum, L. Tiếp tục nghiên cứu xây dựng đường plantarum, L. acidilactici, B. subtilis cong sinh trưởng và khảo sát các yếu tố natto. Kết quả thí nghiệm khảo sát độ đặc ảnh hưởng đến mật độ thực khuẩn thể hiệu của 3 dòng thực khuẩn thể thể theo thời gian. Đồng thời, phân lập vi pAh17.5TG, pAh18.1TG và pAh19.1TG khuẩn A. hydrophila tại các vùng nuôi 129
5. Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học khác tại ĐBSCL và trên các đối tượng ứng dụng thực khuẩn thể như một tác thủy sản khác để mở rộng thí nghiệm nhân kiểm soát sinh học bệnh do A. khảo sát phổ xâm nhiễm nhằm làm tiền hydrophila gây ra. đề cho những nghiên cứu tiếp theo nhằm TÀI LIỆU THAM KHẢO ACKERMANN, H.W. 2007. 5500 Phages examined in the electron microscope. Archives of Virology. Vol.152: 227-243. EL-ARABY DA, GAMAL EL-DIDAMONY AND MARIHAN MEGAHED TH. 2016. New approach to use phage therapy against Aeromonas hydrophila induced motile Aeromonas Septicemia in Nile Tilapia. Journal of Marine Science: Research & Development. Vol.6 (3): 1-6. JIAN-BIN WANG, NIEN TSUNG LIN, YI HSIUNG TSENG, SHU FEN WEN. 2016. Genomic Characterization of the Novel Aeromonas hydrophila Phage Ahp1 Suggests the Derivation of a New Subgroup from phiKMV-Like Family. PLoS ONE. Vol.11 (9): 1-20. TỪ THANH DUNG, M CRUMLISH, NGUYỄN THỊ NHƯ NGỌC, NGUYỄN QUỐC THỊNH VÀ ĐẶNG THỤY MAI THY. 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá Tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Thủy Sản. 137-142. 130