Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản ở vùng phá Tam Giang, Thừa Thiên Huế

Nội dung text: Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản ở vùng phá Tam Giang, Thừa Thiên Huế

1. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 17, Số 2 (2020) PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN PHÂN GIẢI TINH BỘT TỪ HỒ NUÔI THỦY SẢN Ở VÙNG PHÁ TAM GIANG, THỪA THIÊN HUẾ Hoàng Dương Thu Hương*, Nguyễn Thị Hồng Thảo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế *Email:thuhuongcnk32@gmail.com Ngày nhận bài: 26/6/2020; ngày hoàn thành phản biện: 3/7/2020; ngày duyệt đăng: 02/10/2020 TÓM TẮT Từ 12 mẫu đất đã phân lập được 60 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột, số lượng vi khuẩn dao động trong khoảng 1,52 x 106 CFU/g – 6,23 x 106 CFU/g. Tuyển chọn được hai chủng vi khuẩn T1 và T12 có khả năng phân giải tinh bột mạnh với kích thước vòng phân giải đạt 25,33 mm – 25,67 mm. Nghiên cứu về điều kiện nuôi cấy đã chỉ ra rằng, hai chủng vi khuẩn này có sự tích lũy sinh khối và hoạt tính enzyme mạnh nhất trong môi trường có pH 6,5 – 7,0 sau 48 – 60 giờ. Từ khóa: Chủng vi khuẩn, điều kiện nuôi cấy, phân giải tinh bột. 1. MỞ ĐẦU Tam Giang là vùng đầm phá nước lợ lớn nhất ở khu vực Đông Nam Á, nằm trong hệ đầm phá Tam Giang - Cầu Hai, thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế. Trong những năm gần đây, nghề nuôi thủy sản ở đây phát triển mạnh mẽ, hàng năm khai thác hàng nghìn tấn hải sản, cá, tôm các loại [4]. Tuy nhiên, ảnh hưởng của ngành nuôi trồng thủy sản đến môi trường, đặc biệt là nguồn nước nói chung và ao hồ nói riêng đang ở tình trạng ô nhiễm đáng báo động gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ sinh thái và sức khỏe của người dân trong khu vực. Hiện nay, việc sử dụng các biện pháp sinh học để xử lí nước thải đã được chứng minh là có hiệu suất xử lý cao hơn những biện pháp hóa lý khác [2]. Cơ sở của việc xử lý chất thải các ao nuôi bằng vi sinh vật (VSV) là sử dụng VSV để phân giải các chất ô nhiễm hữu cơ có trong chất thải, bã thải. Nhờ hoạt động của VSV, các chất ô nhiễm được chuyển hóa về nồng độ cho phép, ở mức không gây hại tới môi trường. Để tìm hiểu về khả năng phân giải các chất hữu cơ như tinh bột của vi khuẩn trong chất thải ao nuôi và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có tiềm năng ứng dụng trong các phương pháp xử lí sinh học, làm cơ sở cho nghiên cứu tạo chế phẩm VSV hữu ích làm 107
2. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản sạch chất thải và góp phần xử lý ô nhiễm môi trường, chúng tôi tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn này từ các hồ nuôi thủy sản ở vùng Tam Giang, Thừa Thiên Huế. 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu, địa điểm và thời gian thực hiện Các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột phân lập từ mẫu đất ở các hồ nuôi thủy sản ở vùng phá Tam Giang, Thừa Thiên Huế. Địa điểm thu mẫu: Vùng phá Tam Giang, Thừa Thiên Huế. Thời gian thực hiện: từ tháng 12/2019 đến tháng 4/2020. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp phân lập và đếm số lượng tế bào Sử sụng phương pháp Koch để phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột trên môi trường thạch Vinogradski thạch đĩa nhưng thay nguồn carbon bằng tinh bột [3]. Xác định số lượng tế bào vi khuẩn trong mẫu bằng phương pháp đếm gián tiếp thông qua số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch đĩa [3]. 2.2.2. Sơ tuyển các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột Các chủng vi khuẩn được cấy vạch lên bề mặt thạch đĩa, nuôi cấy ở thời gian và nhiệt độ thích hợp sau đó nhuộm màu bằng thuốc nhuộm Lugol [1]. 2.2.3. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên thạch Các chủng vi khuẩn tuyển chọn được nuôi cấy lắc tốc độ 120 rpm ở nhiệt độ phòng với thời gian thích hợp. Ly tâm dịch nuôi bằng máy ly tâm lạnh, tốc độ 8000 rpm trong 10 phút để thu phần dịch nổi. Chuẩn bị các đĩa petri chứa thạch - cơ chất: gồm 2% thạch và 0,5% cơ chất là tinh bột. Tạo giếng thạch có đường kính 12 mm, dùng micropipette hút 0,7 ml dịch enzyme vào giếng. Làm lạnh trong 12 giờ (4 - 6ᵒC) rồi đưa vào tủ ấm 28 - 30ᵒC ủ trong 36 giờ. Nhuộm màu bằng Lugol và đo đường kính vòng phân giải cơ chất [1]. 2.2.4. Xác định sinh khối vi khuẩn Phần sinh khối được tái huyền phù để tiến hành đo OD bằng máy quang phổ kế ở bước sóng 610 nm, dựa vào đồ thị chuẩn để xác định sinh khối tạo thành. 108
3. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 17, Số 2 (2020) 2.2.5. Xác định một số đặc điểm hình thái Quan sát đại thể trên môi trường thạch đĩa, sử dụng phương pháp làm tiêu bản phiến kính để quan sát hình thái tế bào [3]. 2.2.6. Thăm dò một số điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme amylase của vi khuẩn Tối ưu hóa một số điều kiện nuôi cấy: thời gian, pH thích hợp cho sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi khuẩn bằng phương pháp “ một lúc – một biến” (one – variable – at – a – time – method) 2.2.7. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2016 và phân tích ANOVA (Duncan’s test p < 0,05) bằng chương trình SPSS 20.0. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột 3.1.1. Tìm hiểu số lượng vi khuẩn Từ 12 mẫu đất ở đáy hồ nuôi thủy sản ở vùng phá Tam Giang - Thừa Thiên Huế đã tiến hành phân lập và đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột trên môi trường thạch cơ bản (chứa tinh bột). Kết quả về số lượng vi khuẩn phân giải tinh bột được trình bày ở bảng 1. Bảng 1. Số lượng vi khuẩn trong các mẫu đất hồ nuôi thủy sản Số lượng vi Ký hiệu Địa điểm thu mẫu Thời gian STT pH khuẩn mẫu thu mẫu CFU/g (x106) 1 CT1 Hồ nuôi thủy sản ở cồn Tè 6,8 6/12/2019 6,26 2 CT2 Hồ nuôi thủy sản ở cồn Tè 4,2 6/12/2019 3,45 3 CT3 Hồ nuôi thủy sản ở cồn Tè 5,0 6/12/2019 6,32 4 CT4 Hồ nuôi thủy sản ở cồn Tè 4,1 6/12/2019 3,75 5 CT5 Hồ nuôi thủy sản ở cồn Tè 4,2 6/12/2019 2,98 6 CT6 Hồ nuôi thủy sản ở cồn Tè 4,0 6/12/2019 3,31 7 RC1 Hồ nuôi thủy sản ở Rú Chá 5,5 7/1/2020 4,14 8 RC2 Hồ nuôi thủy sản ở Rú Chá 5,3 7/1/2020 3,56 9 RC3 Hồ nuôi thủy sản ở Rú Chá 4,2 7/1/2020 2,88 10 RC4 Hồ nuôi thủy sản ở Rú Chá 4,2 7/1/2020 3,11 11 CT7 Hồ nuôi thủy sản ở Cồn Tè 3,7 3/2/2020 1,52 12 CT8 Hồ nuôi thủy sản ở Cồn Tè 4,1 3/2/2020 3,37 Từ kết quả bảng 1 cho thấy, số lượng vi khuẩn có sự khác biệt và dao động tùy từng vị trí lấy mẫu. Số lượng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột cao nhất là mẫu 109
4. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản CT3 (6,23 x106 CFU/g đất khô) được lấy từ hồ nuôi thủy sản ở Cồn Tè, số lượng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột thấp nhất là mẫu CT7 (1,52 x106 CFU/g đất khô) cũng được lấy tại địa điểm này. Như vậy, trên cùng một địa điểm lấy mẫu nhưng ở các thời điểm khác nhau thì số lượng vi khuẩn không giống nhau, điều này có thể phụ thuộc vào nhiệt độ, pH và thời gian thu mẫu khác nhau. 3.1.2. Đánh giá khả năng phân giải tinh bột của vi khuẩn Bảng 2. Khả năng phân giải tinh bột của các chủng phân lập Khả năng phân giải Chiều rộng vạch phân giải Số chủng Tỷ lệ (%) Yếu w < 10 9 15,00 Trung Bình 10 ≤ w < 15 26 43,33 Mạnh 15 ≤ w < 20 18 30,00 Rất mạnh w ≥ 20 7 11,67 Từ kết quả ở bảng 2 cho thấy, tất cả các chủng vi khuẩn phân lập được đều có khả năng phân giải tinh bột nhưng ở các mức độ khác nhau. Có 26 chủng có khả năng phân giải tinh bột trung bình, chiếm tỷ lệ cao nhất (43,33%). Các chủng có khả năng phân giải tinh bột mạnh chiếm tỷ lệ khá lớn (30,00%). Thông qua sơ tuyển phát hiện được 7 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột rất mạnh chiếm tỷ lệ 11,67%. Hình 1. Vạch phân giải tinh bột của một số chủng vi khuẩn mạnh 3.1.3. Hoạt lực phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn tuyển chọn Trong số các chủng vi khuẩn phân lập được, chúng tôi chọn ra 10 chủng có kích thước vạch phân giải lớn nhất để tiến hành tuyển chọn bằng phương pháp khuếch tán thạch đĩa. Kết quả được trình bày ở bảng 3. 110
5. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 17, Số 2 (2020) Bảng 3. Kích thước vòng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn STT Chủng Kích thước (mm) 1 T1 25,33a 2 T6 20,67bc 3 T12 25,67a 4 T14 21,33b 5 T15 16,33de 6 T17 18,67cd 7 T30 21,00b 8 T43 16,67de 9 T47 17,33d 10 T55 19,67c Ghi chú: Sự sai khác giữa các chữ cái trên cùng một cột biểu hiện sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (Ducans’ test) Trong 10 chủng đã xác định hoạt tính enzyme, chủng T1 và T12 có vòng phân giải lớn nhất, kích thước vòng phân giải lần lượt là 25,33 mm và 25,67 mm. Do đó chúng tôi chọn chủng T1 và T12 làm đối tượng cho các nghiên cứu tiếp theo. Hình 2. Vòng phân giải tinh bột của các chủng vi khuẩn mạnh 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn 3.2.1. Chủng T1 - Khuẩn lạc hình tròn, kích thước 2-3 mm, bề mặt trơn, nhẵn, màu trắng sữa, độ dày 1-2 mm. 111
6. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản - Tiến hành nhuộm Gram âm chủng T1 và quan sát trên kính hiển vi với độ phóng đại x100, cho thấy tế bào chủng T1 bắt màu hồng, có hình que dài và đứng riêng lẻ. Hình 3. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng T1 (x100). 3.2.2. Chủng T12 - Khuẩn lạc hình tròn, kích thức 2-3 mm, bề mặt trơn, nhẵn, màu trắng trong, dộ dày 1-2 mm. - Tiến hành nhuộm Gram âm chủng T12 và quan sát trên kính hiển vi với độ phóng đại x100, cho thấy tế bào chủng T12 bắt màu hồng có hình tròn và đứng riêng lẻ. Hình 4. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng T12 (x100) 3.3. Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt tính enzyme của vi khuẩn Để thăm dò ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng phát triển và hoạt tính enzyme của vi khuẩn, tiến hành nuôi cấy lắc hai chủng vi khuẩn trong môi 112
7. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 17, Số 2 (2020) trường Vinogradski dịch thể. Sau các mốc thời gian 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ xác định hoạt tính amylase và sinh khối 2 chủng vi khuẩn. Kết quả nghiên cứu cho thấy, sau 12 giờ, sự tích lũy sinh khối và hoạt tính amylase bắt đầu tăng mạnh ở cả hai chủng vi khuẩn và đạt cực đại ở 48 giờ đối với chủng T1 và 60 giờ đối với chủng T12. Sau các khoảng thời gian này, hoạt tính amylase và sinh khối bắt đầu giảm. Bảng 4. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng, phát triển và hoạt tính amylase của hai chủng T1 và T12 T1 T12 Thời gian Sinh khối Đường kính vòng Sinh khối khô Đường kính vòng nuôi cấy khô phân giải (mm) (mg/ml) phân giải (mm) (giờ) (mg/ml) 12 1,31f 13,67f 0,41f 17,33e 24 1,66d 23,00c 4,45e 19,67d 36 1,83b 25,33b 0,87d 20,00cd 48 2,03a 27,00a 1,51b 22,33b 60 1,72c 20,33d 2,07a 25,67a 72 1,50e 14,67e 1,39c 20,33c Ghi chú: Sự sai khác giữa các chữ cái trên cùng một cột biểu hiện sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (Ducans’ test) 3.3. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh trưởng, phát triển và hoạt tính enzyme của vi khuẩn pH môi trường được điều chỉnh ở các mức 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0 bằng đệm phosphate; sau thời gian nuôi cấy thích hợp (48 giờ đối với chủng T1 và 60 giờ đối với chủng T12) xác định hoạt tính amylase và sinh khối 2 chủng vi khuẩn. Kết quả nghiên cứu cho thấy, cả hai chủng vi khuẩn đều có khả năng sinh trưởng và phát triển ở khoảng pH khá rộng trong đó chủng T1 thích hợp nhất ở pH 6,5 và chủng T12 thích hợp nhất ở pH 7. Khi pH môi trường tăng lên, sinh khối và hoạt tính enzyme của 2 chủng vi khuẩn đều giảm. Bảng 5. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng phát triển và hoạt tính amylase của hai chủng T1 và T12 T1 T12 Sinh khối pH Đường kính vòng Sinh khối khô Đường kính vòng khô phân giải (mm) (mg/ml) phân giải (mm) (mg/ml) 5,0 1,00g 12,33g 1,95e 17,33f 5,5 1,35f 21,00d 2,16d 19,00e 6,0 3,05c 24,67c 2,51bc 24,00d 113
8. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản T1 T12 Sinh khối pH Đường kính vòng Sinh khối khô Đường kính vòng khô phân giải (mm) (mg/ml) phân giải (mm) (mg/ml) 6,5 5,34a 28,00a 2,73b 26,67c 7,0 4,24b 26,33b 3,30a 45,00a 7,5 2,31d 18,33e 3,06ab 27,33b 8,0 1,63e 15,67f 2,37c 13,67g Ghi chú: Sự sai khác giữa các chữ cái trên cùng một cột biểu hiện sai khác có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 (Ducans’ test) 4. KẾT LUẬN Số lượng vi khuẩn có khả năng phân giải tinh bột phân lập từ mẫu đất của các hồ nuôi ở vùng phá Tam Giang dao động trong khoảng từ 1,52 x 106 CFU/g - 6,32 x 106 CFU/g. Trong 60 chủng vi khuẩn phân giải tinh bột phân lập được từ 12 mẫu đất, đã tuyển chọn được 2 chủng T1 và T12 có khả năng phân giải tinh bột mạnh. Điều kiện tối ưu cho sinh trưởng phát triển và hoạt tính enzyme mạnh của 2 chủng vi khuẩn: - Chủng T1: thời gian nuôi cấy là 48 giờ, pH môi trường 6,5. - Chủng T12: thời gian nuôi cấy là 60 giờ, pH môi trường 7. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đoàn Xuân Mượu, Phạm Văn Ty, 1978. Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật, Tập 2. Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [2]. K. Selvam, T. Selvankumar, R. Rajiniganth, P. Srinivasan, C. Sudhakar, B. Senthilkumar, M. Govarthanan (2016), "Enhanced production of amylase from Bacillus sp. using groundnut shell and cassava waste as a substrate under process optimization: Waste to wealth approach", Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, Vol.7, pp. 250 - 256. [3]. Phạm Thị Ngọc Lan, 2012. Giáo trình thực tập Vi sinh vật học, Nxb Đại học Huế. [4]. á_Tam_Giang. 114
9. TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế Tập 17, Số 2 (2020) ISOLATION AND SELECTION OF AMYLOLYTIC BACTERIA FROM AQUACULTURE PONDS IN TAM GIANG LAGOON , THUA THIEN HUE PROVINCE Hoang Duong Thu Huong*, Nguyen Thi Hong Thao Faculty of Biology, University of Sciences, Hue University *Email: thuhuongcnk32@gmail.com ABSTRACT In this study, sixty strains of amylolytic bacteria were isolated from 12 soil samples of aquaculture ponds. The number of bacteria strains is around 1,52 x 106 CFU/g - 6,32 x 106 CFU/g. Among this number, two strains called T1 and T12 with strong starch hydrolysis ability with enzyme activity at 25,33 mm - 25,67 mm were seclected. This study indicates that these two amylolytic bacteria strains have the best rise of biomass and enzyme at pH 6,5 - 7,0, after 48-60 hours. Keywords: Amylolytic, bacteria strains, cultural conditions. Hoàng Dương Thu Hương sinh ngày 30/04/1990. Bà tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học năm 2013, tốt nghiệp Thạc sĩ chuyên ngành Công nghệ sinh học năm 2015 tại Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. Từ năm 2013 đến nay là cán bộ giảng dạy tại Bộ môn Công nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế. 115
10. Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải tinh bột từ hồ nuôi thủy sản 116