Đặc tính phân tử và phân bố mô bệnh học của gene fabp (fatty acid binding protein) ở Sán máng schistosoma mekong

Nội dung text: Đặc tính phân tử và phân bố mô bệnh học của gene fabp (fatty acid binding protein) ở Sán máng schistosoma mekong

1. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II ĐẶC TÍNH PHÂN TỬ VÀ PHÂN BỐ MÔ BỆNH HỌC CỦA GENE FABP (FATTY ACID BINDING PROTEIN) Ở SÁN MÁNG SCHISTOSOMA MEKONG Đỗ Thị Cẩm Hồng1*, Wanwisa Peonsamut2, Manaw Sangfuang2, Yanin Limpanont3, Charoonroj Chotwiwattanakun4, Prasert Sobhon5, Narin Preyavichyapugdee2 TÓM TẮT Fatty Acid-Binding Protein (FABP) là một protein liên kết lipid nội bào, có trọng lượng phân tử khoảng 14-15 kDa và đóng vai trò quan trọng cho sự tổng hợp màng ngoài và tái tạo da. FABP là một trong sáu loại protein đã được WHO lựa chọn làm ứng cử viên cho phát triển vắc-xin để phòng ngừa bệnh sán máng (Bilharziasis) do giống Schistosoma sống trong máu của người và động vật gây ra ở trong vùng nhiệt đới, nơi mà cộng đồng người nghèo không có nguồn nước sạch và điều kiện vệ sinh đầy đủ. Trong nghiên cứu này, trình tự ADN bổ sung (cADN) mã hoá protein FABP của Schistosoma mekongi trưởng thành (SmekFABP) được tạo dòng và phân tích trình tự. Kết quả thu được đoạn trình tự nucleotide của gen SmekFABP với chiều dài 582 bp có chứa khung đọc mở mã hoá gen SmekFABP với chiều dài 132 axít amin. Trình tự axít amin của protein SmekFABP có sự tương đồng với FABP của S. japonicum (GenBank: AA64426) đến 95,4%, và với các loài Schistosoma khác bao gồm S. mannsoni và S. haematobium lần lượt là 91,7% và 90,2%. Trọng lượng phân tử của protein SmekFABP là 14.84 kDa và protein FABP tái tổ hợp (rSmekFABP) có gắn đuôi histidine là 15,5 kDa. Kết quả điện di trong gel SDS-PAGE, chúng tôi ghi nhận 2 vạch, một vạch chính có trọng lượng 26 kDa; đây có thể là protein rSmekFABP ở dạng liên kết hai đơn vị (dimer) và một vạch mờ có trọng lượng 15,5 kDa là protein rSmekFABP ở dạng đơn (monomer). Độ tương đồng và đồng dạng của protein SmekFABP khi so sánh với S. japonicum rất cao, và sự phân bố ở các vị trí mô bệnh học cũng giống nhau, điều này cho thấy gen FABP của hai loài ký sinh trùng này có chung nguồn gốc. Trong khi, độ tương đồng và đồng dạng của protein FABP giữa S. mekongi và ký chủ động vật hữu nhũ rất thấp. Do đó, protein này có thể được dùng để phát triển vắc-xin chống lại bệnh nhiễm trùng S. mekongi mà không bị tương tác với protein FABP của ký chủ trong quá đáp ứng sinh miễn dịch bằng vắc-xin. Thêm vào đó, nghiên cứu này sử dụng 5 chương trình tin sinh học khác nhau bao gồm Hoop & Woods; Welling, Parker, B-EpiPred và ABCpred để phân tích protein FABP thu được, kết quả là, một epitope kháng nguyên ở dạng peptid có trình tự từ vị trí 87-DSESKITQTQKDAKN-101 được ghi nhận. Theo các nghiên cứu trước đây, đoạn peptide này là loại epitope kháng nguyên tiềm năng đối các protein kháng thể CTL và MHC-I trong hệ thống miễn dịch của ký chủ động vật hữu nhũ. Từ khóa: FABP, Schistosoma mekongi, kháng nguyên, vắc xin, CTL (Cytotoxic T lymphocyte), MHC-I (Major Histocompatility Conplex –I). 1 Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II 2 Trường Đại học Silpakorn, Thái Lan 3 Applied Malacology Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, Bangkok, Thailand 4 Mahidol University, Nakhonsawan Campus, Nakhonsawan, Thailand 5 Department of Anatomy, Faculty of Science, Mahidol University, Bangkok, Thailand * Email: camhong573@gmail.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 45
2. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II I. GIỚI THIỆU mà được hấp thụ từ ký chủ động vật (Bennett Bệnh sán máng (được gọi là Bilharziasis) & Caulfield, 1991). FABP là một trong 6 ứng do giống Schistosoma sống trong máu của người cử viên phát triển vắc-xin đã được WHO lựa và động vật gây ra trong vùng nhiệt đới nơi cộng chọn để chống lại bệnh sán máng (Bergquist N, đồng người nghèo không có nguồn nước sạch 1995). Thêm vào đó, nghiên cứu của Rahmani và điều kiện vệ sinh đầy đủ (Santos, 2011). Ước và cộng sự (2019) cho thấy FABP có chứa tính có khoảng 4.400 đến 200.000 người chết epitope kháng nguyên để phát triển vắc-xin đa hàng năm do bệnh sán máng gây ra trên toàn thế chủng chống lại S. mansoni. Kết quả phân tích giới (Thétiot ‐ Laurent & ctv., 2013); và sự lây tin sinh học, nhiều epiotpe kháng nguyên có truyền đã tồn tại ở 75 đến 76 quốc gia (Mohamed thể kích thích phản ứng sinh miễn dịch trong & ctv., 2018). Ít nhất, 6 loài sán lá nhiễm ở người hệ thống miễn dịch của ký chủ động vật hữu như Schistosomam haematobium, Schistosoma nhũ để sản xuất các protein kháng thể bao gồm intercalatum, Schistosoma guineesis, CTL (Cytotoxic T lymphocyte), MHC-I (Major Schistsosoma japonicum, Schistosoma mansoni Histocompatility Conplex –I) (Rahmani & ctv., và Schitosoma mekongi (Gordon & ctv., 2019). 2019). Năm 1978, S. mekongi được xác định lần đầu Nghiên cứu này tập trung vào việc tạo dòng tiên (Voge & ctv., 1978); loài này đặc hữu ở lưu gen, phân tích đặc tính, sự phân bố ở các mô vực sông Mekong, và một vài nơi ở Thái Lan và dự đoán tế bào B sinh miễn dịch của gen (Sornmani & ctv., 1971). Bệnh sán máng gây FABP ở S. mekongi. Điều này làm cơ sở cho ra bởi các phản ứng miễn dịch đối với trứng việc nghiên cứu phát triển vắc-xin chống lại Schistosoma bị nhiễm trong các mô. Trứng giải S. mekongi cũng như là giải pháp bền vững để phóng các kháng nguyên dẫn đến kích thích phòng bệnh sán máng trong tương lai. phản ứng tạo u hạt liên quan đến tế bào T, đại II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP thực bào và bạch cầu dẫn đến các dấu hiệu NGHIÊN CỨU lâm sàng của bệnh (Othman & Soliman, 2015; 2.1. Tạo dòng và giải trình tự gen FABP Webster & ctv., 2013). của Schistosoma mekongi (SmekFABP) Hiện nay, Praziquantel (PZQ) là lựa chọn Sán máng S. mekongi trưởng thành (nguồn để điều trị bệnh sán máng nhờ vào phổ rộng, sán máng Schistosoma mekongi thuộc chủng an toàn và hiệu quả cao (Vale & ctv., 2017). Lào được cảm nhiễm vào ốc Neotricula aperta Mặc dù PZQ có hiệu quả, tuy nhiên nó không và chuột chủng ICR, được thực hiện bởi the ngăn ngừa sự tái nhiễm (Wu & ctv., 1994), và Applied Malacology Unit, Department of Social việc sử dụng lặp lại PZQ trong điều trị có thể Medicine and Environment, Faculty of Tropical dẫn tới các thể schistosomes kháng PZQ (Cupit Medicine, Mahidol University, Bangkok). RNA & Cunningham, 2015). Do đó, việc phát triển tổng số được tách chiết bằng thuốc thử TRIzol vắc-xin được xem như là một trong những chiến (Molecular Centre, Inc.), được thực hiện theo lược bền vững để kiểm soát sự lây truyền bệnh hướng dẫn của nhà sản xuất. Trình tự cADN một cách lâu dài (Fonseca & ctv., 2012). một phần của SmekFABP được khuếch đại bằng FABP là một protein liên kết lipid nội bào, PCR với bộ mồi bao gồm mồi xuôi (5’-ACT có trọng lượng phân tử thấp (14-15 kDa) và TTA GGC GTT CAG TCA ATC GGA A-3’) đóng vai trò quan trọng cho sự tổng hợp màng và mồi ngược (5’-GCA ATG TTT ATT GAA ngoài và tái tạo da. Tuy nhiên, FABP không CAA AAG TGA AGC TG-3’). Các mồi này thể được tổng hợp trong cơ thể bởi giun sán, được thiết kế dựa vào GenBank (FN315763.1) 46 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021
3. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II của S. japonicum. PCR được thực hiện 35 chu máy tán siêu âm và protein được tinh sạch bằng kỳ ở 940C trong 30 giây, 500C trong 30 giây và phương pháp ly tâm qua cột Ni-NTA 15ml 720C trong 90 giây. Sản phẩm PCR được gắn (Qiagen, Đức). Protein rSmekFABP tinh khiết vào vector pGEM-T (Promega, Hoa Kỳ) trước được thẩm tách trong PBS lạnh trong 3 giờ. khi giải trình tự. 2.4. Dự đoán các vị trí epitope kháng 2.2. Xác định đặc tính protein SmekFABP nguyên Đặc tính protein SmekFABP được xác định Các epitope kháng nguyên được xác định bằng công cụ BLAST ( bằng cách sử dụng một số chương trình dự BLAST) và chương trình máy tính Prot của Thụy đoán như sau: Hopp & Woods (1981); Welling sĩ ( So sánh độ & cộng sự (1985); HPLC / Parker & cộng tương đồng từ các loài Schistosoma được thực sự (1986); Kolaskar & Tongaonkar (1990); hiện bởi chương trình Clustal Omega (https:// B-EpiPred (Larsen & ctv., 2006) và ABCpred www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo). Phương (Saha & Raghava, 2006). pháp phân tích Neighbourhood (Saitou & Nei, 2.5. Xác định sự phân bố của SmekFABP 1987) được thực hiện bằng phần mềm Mega X trong mô ký sinh bằng phương pháp lai In Situ (Kumar & ctv., 2018) với bootstrap 1.000 lần Sán máng Schistosoma mekongi trưởng lặp lại (Felsenstein, 1985). Mô hình 3-D của thành được cố định trong môi trường protein FABP được dự đoán bằng chương trình paraformaldehyde 2% ở 40C trong 18 giờ. Sau I-TASSER (Yang & Zhang, 2015). đó, mô được xử lý thông qua quá trình xử lý 2.3. Biểu hiện gen SmekFABP tái tổ hợp mô thông thường trước khi được đúc thành khối (rSmekFABP) parafin. Phần mô được cắt lát có độ dày 5 mm Phương pháp thực hiện được dựa theo và đính trên các lame có tráng silan. Các đoạn phương pháp được mô tả bởi Sripa và cộng mồi xuôi và ngược của gen SmekFABP được sự (2017). Trình tự ADN của gen FABP được sử dụng để sản xuất mẫu dò có đánh dấu DIG- khuếch đại từ cADN của sán máng trưởng thành oligonucleotide (Roche, Đức) từ cADN của S. S. mekongi bằng cách sử dụng mồi xuôi có gắn mekongi. Các mẫu dò này được dùng để lai với vị trí nhận dạng của enzyme cắt giới hạn NdeI các mô trên lame. Phản ứng lai được ủ ở 500C ở đầu 5’ của mồi (5’-CATATGGCGACTTT trong 12 giờ. Màu được hình thành bằng cách GGGTACTGGGATGA-3’) và mồi ngược có sử dụng chất nền NBT/BCIP. Sau đó các lát cắt gắn vị trí nhận dạng của enzyme cắt giới hạn được nhuộm tương phản với màu nâu Bismarck XhoI cùng với đoạn 6-histidine ở đầu 5’ của brown Y (Sigma, Mỹ). Các lát cắt này được mồi (5’- CTCGAGTTAATGATGATGATGAT làm sạch bằng Xylene và được che phủ bằng GATGAACATTCTCATATTCTTTTATTTGT miếng lamen trước khi quan sát dưới kính hiển CG-3’), với sản phẩm khuếch đại 420 bp. Sản vi (Salachan & ctv., 2017). phẩm PCR được gắn vào vector pET-17b trước III. KẾT QUẢ khi biến nạp vào chủng E. coli BL21 để biểu 3.1. Phân tích gen SmekFABP hiện protein rSmekFABP. Vi khuẩn này được Kết quả khuếch đại bằng phương pháp PCR nuôi cấy trong môi trường LB có chứa 1 μg/ml cho thấy trình tự đoạn ADN chứa gen SmekFABP ampicillin và ủ ở 370C cho đến khi OD600 đạt có chiều dài 582 bp (Hình 1). Đoạn trình tự này đến 0,6–0,8. Sau đó cảm ứng bằng IPTG 1mM có chứa khung đọc mở mã hóa cho protein FABP và ủ ở 300C trong 6 giờ. Protein rSmekFABP có chiều dài 132 axít amin với khối lượng phân thu được bằng cách ly giải tế bào vi khuẩn bằng tử được dự đoán là 14,82 kDa (Hình 2). TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 47
4. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 1. Sản phẩm khuếch đại bằng PCR đối với đoạn cADN của gen SmekFABP. Giếng M: thang chỉ thị 100 bp; giếng 1-4: đoạn gen SmekFABP có kích thước 582 bp. Hình 2. Đoạn trình tự đoạn ADN và trình tự axít amin của gen SmekFABP. Khung đọc mở bao gồm bộ ba mở đầu ATG mã hoá Methionin (M) và bộ ba kết thúc TAA không mã hoá. 3.2. So sánh trình tự nucleotide và axít protein SmekFABP với các proetin FABP của S. amin của SmekFABP japonicum (SjFABP_AAA64426), S. mansoni Tỷ lệ tương đồng giữa trình tự nucleotide (Sm14FABP_2POA_A), S. haematobium và axít amin của SmekFABP khi so sánh với các (ShFABP_BAF62288) và S. bovis (SbFABP_ loài sán máng khác và các ký chủ động vật hữu AAT39384) lần lượt giảm dần từ 95,4 - 89,4% nhũ được trình bày trong Bảng 1 và 2. (Bảng 2). Kết quả này cho thấy độ tương Trong đó, tỷ lệ tương đồng đối với trình đồng gen và protein FABP trong cùng loài tự nucleotide của SmekFABP với các FABP Schistosoma rất cao, trong đó, độ tương đồng từ các loài sán máng cùng loài Schistosoma giữa S. mekongi và S. japonicum là cao nhất. bao gồm S. japonicum (SjFABP_L23322.1), Kết quả so sánh SmekFABP với FABP S. mansoni (SmFABP_M60895.1), S. của các loài sán Fasciola khác bao gồm F. haematobium (ShFABP_AB114679.1) và S. hepatica (Fh_AJ250098.1) và F. gigantica bovis (SbFABP_AY615730.1) lần lượt là 88,7, (Fg_U52908.1) có tỷ lệ tương đồng mức độ 63,0, 62,6 và 57,2% (Bảng 1). Trong khi, tỷ nucleotide là 36,2 - 47,2% ở (Bảng 1); Trong lệ tương đồng trình tự axít amin khi so sánh khi đó ở mức độ axít amin có tỷ lệ tương 48 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021
5. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II đồng từ 39,3 - 48,4% đối với F. hepatica (Fh_ đồng ở mức độ nucleotide là 26,6 - 27,1% CAB65015) và F. gigantica (Fg_AAB06722) (Bảng 1); Trong khi đó, ở mức độ axít amin (Bảng 2). Điều này cho thấy tỷ lệ tương đồng có tỷ lệ tương đồng từ 25,7 - 27,2% đối gen và protein FABP giữa S. mekongi và với các với chuột (RatFABP_2JU3_A) và người loài sán khác tương đối thấp. (HumanFABP_3STN_A) (Bảng 2). Điều này Kết quả so sánh SmekFABP với FABP cho thấy tỷ lệ tương đồng gen và protein FABP của các ký chủ động vật hữu nhũ bao gồm giữa S. mekongi và với các ký chủ động vật hữu chuột (RatFABP_BC086947.1) và người nhũ là rất thấp. (HumanFABP_BC032801.1) có tỷ lệ tương Bảng 1. Tỷ lệ tương đồng của các trình tự nucleotide của gen SmekFABP và các loài khác. Bảng 2. Tỷ lệ tương đồng của các trình tự axít amin của protein SmekFABP và các loài khác. Cây phát sinh loài được xây dựng bằng S. haematobium (ShFABP_BAF62288) và S. chương trình Bio Edit (Neighborhood 1.000 lần bovis (SbFABP_AAT39384) nằm trong nhóm lặp lại) cho thấy SmekFABP nằm trong nhóm với khác và ở nhánh kế cận trên cây phát sinh loài. FABP của S. japonicum (SjFABP_AAA64426) Trong khi, FABP của động vật và người nằm và S. japonicum (SjFABP_AAG50052). Còn trong nhóm khác và ở nhánh xa trên cây phân các loài là S. mansoni (Sm14FABP_2POA_A), phát sinh loài (Hình 3). TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 49
6. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Hình 3. Cây phát sinh loài được xây dựng từ gen FABP (kích thước 396 bp) của S. mekongi và các loài khác. SmekFABP nằm trong nhóm với FABP của S. Japonicum. 3.3. Phân tích cấu trúc thứ cấp của trúc bậc ba phổ biến như các protein FABP khác, protein SmekFABP bao gồm 10 đoạn đối song song ở dạng phiến β Cấu trúc thứ cấp của protein SmekFABP và 2 đoạn ở dạng xoắn α, và các vòng cuộn kết được phân tích bằng chương trình I-TESSER nối các đoạn tạo thành sợi peptide (TM-score = (Zhang, 2008). Kết quả cho thấy protein có cấu 0,91 ± 0,06, RMSD = 1,9 ± 1,6Å) (Hình 4). Hình 4. Mô hình cấu trúc bậc 3 của protein SmekFABP. Màu vàng: mười đoạn đối song song ở dạng phiến β; màu hồng: 2 đoạn ở dạng xoắn α; màu xanh: các vòng cuộn kết nối các đoạn tạo thành sợi peptide (TM-score = 0,91 ± 0,06, RMSD = 1,9 ± 1,6Å). 50 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021
7. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 3.4. Biểu hiện protein SmekFABP tái tổ rSmekFABP ở vị trí khoảng 26 kDa và vạch hợp (rSmekFABP) mờ khoảng 23 kDa (Hình 5). Trong khi đó, Protein rSmekFABP được biểu hiện trong rSmekFABP sau khi được thẩm tách, kết quả tế bào vi khuẩn E. coli BL21 và được tinh cho thấy có vạch mờ ở vị trí khoảng 15,5 kDa sạch bằng cột Ni2+ trong điều kiện biến tính. (Hình 6). Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy một vạch 26 kDa 26 kDa 23 kDa 15,5 kDa Hình 5. Bảng gel điện di SDS-PAGE Hình 6. Bảng gel điện di SDS-PAGE của rSmekFABP. của rSmekFABP sau khi thẩm tách. (M): thang chỉ thị; (M): thang chỉ thị; (1): protein trước biểu hiện trong E. coli; (1): protein trước biểu hiện trong E. coli; (2): protein sau khi biểu hiện trong E. coli; (2): protein sau khi biểu hiện trong E. coli. (3): rSmekFABP tinh sạch. 3.5. Xác định epitope kháng nguyên trên các vùng ưa nước trong protein SmekFABP SmekFABP có khả năng sinh miễn dịch bề mặt. Một đoạn Dự đoán vùng epitope kháng nguyên trên 87-DSESKITQTQKDAKN-101 nằm trong vùng bề mặt của protein là bước cần thiết để thiết kế phiến đều được tìm thấy bởi 5 vắc-xin dựa vào các đoạn peptide có khả năng chương trình phân tích (Hopp & Woods; Welling, 𝛽 của protein sinh miễn dịch. Kết quả phân tích cho thấy Parker, B-EpiPred và ABCpred) (Bảng 3). Bảng 3. Các vùng ưa nước tiềm năng và vị trí dự đoán epitope sinh miễn dịch từ các chương trình phân tích khác nhau. Hopp & Woods Welling & al Parker & al Kolaskar & Tangaokar B-Epipred ABCpred 9-11,13-16,18 6-7,9-15,18 9-22 13 30-39,41- 26 16-28 23-38 45 25-59 47,49-51,55,57- 47 58 58-65 61-62,77 69-79 61-76 65,67-104 80,82- 65-105 85,87,90,94- 80-87 87-101 88-103 101 108-112,114-119 119 115-120 109-128 102-109,117-126 121, 126-128 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 51
8. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II 3.6. Sự phân bố FABP trong các mô của manh tràng. Trong khi đó, các tế bào biểu mô ở Schistosoma mekongi bằng kỹ thuật lai In Situ lame đối chứng không lai với mẫu dò đã không Các mặt cắt dọc parafin của S. mekongi bắt màu nâu của thuốc nhuộm (Hình 7). Kết quả trưởng thành được lai với mẫu dò ARN này cho thấy mARN của gen SmekFABP hiện SmekFABP. Các tín hiệu lai dương tính (tế bào diện ở biểu mô và nhu mô của manh tràng của bắt màu nâu của thuốc nhuộm) đã được phát sán máng. hiện trong các tế bào biểu mô và nhu mô của Hình 7. Các mặt cắt dọc của S. mekongi ở giai đoạn trưởng thành được lai với mẫu dò ARN SmekFABP. (A): lame đối chứng không dùng mẫu dò, các tế bào không bắt màu nâu của thuốc nhuộm. (B, C và D): Các lame được lai với mẫu dò cho thấy các tế bào nhu mô (Pc) và tế bào biểu mô (Teg) của manh tràng (Cae) bắt màu nâu của thuốc nhuộm Bismarck brown Y. Thanh tỷ lệ 50 μm. IV. THẢO LUẬN Điều này cho thấy FABP của S. mekongi và S. Kết quả so sánh trình tự nucleotide và axít japonicum có chung nguồn gốc. Đặc tính sinh amin bằng chương trình Omega Clastal và miễn dịch của phân tử FABP từ S. japonicum BioEdit cho thấy trình tự axít amin của FABP đã được báo cáo là có khả năng bảo vệ chống Schistosoma mekongi (SmekFABP) có tỷ lại sự lây nhiễm S. japonicum thông qua thí lệ tương đồng ở mức độ cao với các loài sán nghiệm gây nhiễm (Tu & ctv., 2014; Wei & ctv., máng trong cùng giống Stristosoma. Trình tự 2009). Vì vậy, phân tử SmekFABP cũng có thể axít amin SmekFABP có tỷ lệ tương đồng cao được dùng phát triển vắc-xin chống lại nhiễm nhất khi so sánh với S. japonicum (GenBank: trùng S. mekongi. Ngược lại, độ tương đồng về AAA64426) là 95,4% và với các loài S. mansoni trình tự axít amin của SmekFABP đối với ký và S. haematobium lần lượt là 91,7 và 90,2%. chủ động vật hữu nhũ cho tỷ lệ rất thấp, dao 52 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021
9. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II động từ 25-27,2%. Ngoài ra, kết quả phân tích -SESKITQ-94 tương tự có trong peptide của cây phát sinh loài cho thấy SmekFABP có mối FABP S. mansoni (EKNSESKLTQ) đã được quan hệ tiến hóa xa với các loài ký chủ động vật chứng minh rằng trình tự này có khả năng bảo hữu nhũ. Điều này làm cơ sở tốt để có thể sử vệ kép chống lại sự lây nhiễm của cả S. mansoni dụng SmekFABP phát triển vắc-xin chống lại (sm14) và Fasciola hepatica (Fh15) (Vilar & nhiễm trùng S. mekongi mà không bị ảnh hưởng ctv., 2003). Đoạn peptide của nghiên cứu này đến protein FABP của ký chủ động vật hữu nhũ cũng có một phần (93-TQTQKDAKN-100) trong quá trình sinh miễn dịch bằng tiêm chủng. tương đồng với đoạn peptide “TQTQVDPKNI” Sự dung hợp protein SmekFABP tái tổ hợp của FABP S. mansoni đã phát triển thành (rSmekFABP) với đoạn 6 axít amin histidine vắc-xin kết hợp đa peptide (polypeptide) (6-histidine) được tạo ra trong tế bào vi khuẩn và trở thành vị trí sinh miễn dịch của CTL sau khi cảm ứng với IPTG 1mM. Kết quả phân (Cytotoxic T lymphocyte), MHC-I (Major tích trên gel SDS-PAGE và nhuộm màu xanh Histocompatility Conplex –I) trong hệ thống Coomassie đối với protein rSmekFABP được miễn dịch của ký chủ động vật hữu nhũ. Vì vậy, tinh sạch xuất hiện một băng (vạch) chính ở vị đoạn peptide “87-DSESKITQTQKDAKN-101” trí có trọng lượng phân tử khoảng 26 kDa và 2 của SmekFABP có thể được sử dụng để phát triển vạch mờ ở vị trí có trọng lượng phân tử khoảng vắc-xin chống lại sự nhiễm trùng S. mekongi 23 kDa và 15,5 kDa, trong khi trọng lượng phân hoặc Fasciola spp. trên mô hình động vật trong tử dự đoán của protein rSmekFABP với đoạn 6- tương lai. histidine là 15,64 kDa. Theo báo cáo trước đây, Nghiên cứu này đã chứng minh rằng protein FABP có trọng lượng phân tử từ 13-15 SmekFABP có hiện diện trong tế bào biểu mô kDa (Sripa & ctv., 2017). Trong nghiên cứu này, và nhu mô của giun đực trưởng thành. Phát vạch chính có trọng lượng phân tử 26 kDa, điều hiện này tương tự như kết quả của Gobert và này có thể được tiên đoán rằng rSmekFABP tạo cộng sự (1997), nghiên cứu về protein FABP ở thành protein phức hợp ở dạng 2 đơn vị (dimer). S. japonicum (Sj-FABP). Họ phát hiện ra rằng Trong khi vạch mờ có trọng lượng phân tử 15,5 Sj-FABP khu trú trong tế bào nhu mô và các kDa là rSmekFABP ở dạng đơn (monomer). giọt lipid bên dưới vùng biểu bì của ký sinh Việc tiêm vắc-xin phòng bệnh sán máng là trùng đực. Brito và cộng sự. (2002) đã chứng một trong những chiến lược để loại trừ và tiêu minh rằng protein FABP 14 kDa của S. mansoni diệt tận gốc bệnh sán máng. Nó có thể được sử (Sm14) khu trú trong các mô gần các bề mặt dụng đơn hoặc kết hợp với thuốc tẩy giun sán tiếp xúc của ký sinh trùng và vật chủ. Điều này để giảm sự tái nhiễm ở một khu vực đang diễn cho thấy FABP có thể đóng vai trò quan trọng ra bệnh. Protein FABP là một trong sáu ứng cử trong việc vận chuyển các axit béo, nhưng vẫn viên được chọn để phát triển vắc-xin bởi WHO chưa rõ liệu sự hấp thu xảy ra thông qua mô chống lại bệnh sán máng (Bergquist, 1995). hay ruột vì cả hai mô đều liên quan đến sự hấp Nghiên cứu này, chúng tôi đã dự đoán epitope thu axít béo (Brito & ctv., 2002). Hockley và kháng nguyên trên phân tử protein SmekFABP McLaren (1973) đã chứng minh rằng các axít bằng cách sử dụng công cụ tin sinh học. Kết quả béo hấp thụ ở S. mansoni được thực hiện ở tế cho thấy vùng 87-DSESKITQTQKDAKN-101 bào biểu mô và được lưu trữ trong ruột hoặc được tìm ra bởi các chương trình tin sinh học trong tuyến thực quản. Trong nghiên cứu của (Hopp & Woods; Welling, Parker, B-EpiPred Sirisriro và cộng sự (2002) đã sử dụng kỹ thuật và ABCpred), trong đó đoạn peptide 88 immunoperoxidase để nghiên cứu sự phân bố TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 53
10. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II của FABP ở F. gigantica, kết quả cho thấy nồng Bergquist, N., (1995). Schistosomiasis vaccine độ protein này hiện diện cao nhất trong mô nhu development: approaches and prospects. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 221-227. mô, và các tế bào nhu mô dường như có số Brito, Oliveira, G., Oliveira, S., Street, M., lượng FABP khác nhau. Riengrojpitak, S., Wilson, R., Simpson, A., V. KẾT LUẬN & Correa-Oliveira, R., (2002). Sm14 gene 5.1. Kết luận expression in different stages of the Schistosoma Từ những kết quả trên, nghiên cứu này ghi mansoni life cycle and immunolocalization of the Sm14 protein within the adult worm. Brazilian nhận một số kết luận như sau: Trình tự ADN journal of medical and biological research, của SmekFABP đã được tạo dòng có kích thước 35(3), 377-381. 582 bp và chứa khung đọc mở mã hóa protein Cupit, P. M., & Cunningham, C., (2015). What is FABP là 132 axít amin và trình tự này có sự the mechanism of action of praziquantel and how might resistance strike? Future medicinal tương đồng cao với FABP từ Schistosome spp. chemistry, 7(6), 701-705. (57,2 - 88,7% đối với nucleotide và 89,4% - Felsenstein, J., (1985). Confidence limits on 95,4% đối với trình tự axít amin) và Fasciola phylogenies: an approach using the bootstrap. spp. (36,2 - 47,5% đối với trình tự nucleotide và evolution, 39(4), 783-791. Fonseca, C. T., Braz Figueiredo Carvalho, G., 39,3-48,4% đối với trình tự axít amin). Ngoài Carvalho Alves, C., & de Melo, T. T., (2012). ra, một epitope kháng nguyên có khả năng Schistosoma tegument proteins in vaccine and sinh miễn dịch được dự đoán bằng các chương diagnosis development: an update. Journal of trình tin sinh học là đoạn peptide nằm ở vị trí parasitology research, 2012. 87-DSESKITQTQKDAKN-101. Một phát hiện Gobert, G., Stenzel, D., Jones, M., & McManus, D., (1997). Immunolocalization of the fatty nữa cũng được ghi nhận trong nghiên cứu này là acid-binding protein Sj-FABPc within adult ARN thông tin (mARN) của SmekFABP có sự Schistosoma japonicum. Parasitology, 115(1), hiện diện trong các tế bào biểu mô và nhu mô 33-39. của giun sán trưởng thành. Gordon, C. A., Kurscheid, J., Williams, G. M., Clements, A. C., Li, Y., Zhou, X.-N., Utzinger, 5.2. Đề xuất J., McManus, D. P., & Gray, D. J., (2019). Asian - Sử dụng protein SmekFABP để phát triển schistosomiasis: current status and prospects for vắc-xin phòng bệnh nhiễm S. mekongi. control leading to elimination. Tropical medicine - Phát triển phương pháp chuẩn đoán bằng and infectious disease, 4(1), 40. Hockley, D. J., & McLaren, D. J., (1973). kỹ thuật ELISA để phát hiện kháng nguyên Schistosoma mansoni: changes in the outer nhiễm ở giai đoạn sớm để giúp việc phòng bệnh membrane of the tegument during development nhiễm giun sán tốt hơn. from cercaria to adult worm. International LỜI CẢM ƠN journal for parasitology, 3(1), 13-20. Đề tài này được sự hỗ trợ bởi Chương trình Hopp, T. P., & Woods, K. R. (1981). Prediction of protein antigenic determinants from amino acid học bổng sau đại học quốc tế Thái Lan “Thạc sequences. Proceedings of the National Academy sĩ Khoa học Sinh học cho Nông Nghiệp Bền of Sciences, 78(6), 3824-3828. Vững” thuộc Cơ quan Hợp tác Quốc tế Thái Knopp, S., Person, B., Ame, S. M., Mohammed, Lan (TICA) - Chính phủ Thái Lan. K. A., Ali, S. M., Khamis, I. S., Rabone, M., Allan, F., Gouvras, A., & Blair, L., (2013). TÀI LIỆU THAM KHẢO Elimination of schistosomiasis transmission in Bennett, M., & Caulfield, J., (1991). Specific binding Zanzibar: baseline findings before the onset of of human low-density lipoprotein to the surface a randomized intervention trial. PLoS Negl Trop of schistosomula of Schistosoma mansoni and Dis, 7(10), e2474. ingestion by the parasite. The American journal Kolaskar, A., & Tongaonkar, P. C., (1990). A semi‐ of pathology, 138(5), 1173. 54 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021
11. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II empirical method for prediction of antigenic Saitou, N., & Nei, M., (1987). The neighbor-joining determinants on protein antigens. FEBS letters, method: a new method for reconstructing 276(1-2), 172-174. phylogenetic trees. Molecular biology and Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., & Tamura, evolution, 4(4), 406- 425. K., (2018). MEGA X: molecular evolutionary Santos, F. K. d., (2011). Desenvolvimento e genetics analysis across computing platforms. caracterizaçao de carreadores lipidicos Molecular biology and evolution, 35(6), 1547- nanoestruturados contendo praziquantel. 1549. Sirisriro, A., Grams, R., Vichasri-Grams, S., Larsen, J. E. P., Lund, O., & Nielsen, M., (2006). Ardseungneon, P., Pankao, V., Meepool, A., Improved method for predicting linear B-cell Chaithirayanon, K., Viyanant, V., Tan-Ariya, epitopes. Immunome research, 2(1), 1-7. P., & Upatham, E., (2002). Production and Mohamed, I., Kinung’hi, S., Mwinzi, P. N., characterization of a monoclonal antibody Onkanga, I. O., Andiego, K., Muchiri, G., Odiere, against recombinant fatty acid binding protein M. R., Vennervald, B. J., & Olsen, A., (2018). of Fasciola gigantica. Veterinary parasitology, Diet and hygiene practices influence morbidity 105(2), 119-129. in schoolchildren living in Schistosomiasis Sornmani, S., Kitikoon, V., Harinasuta, C., & endemic areas along Lake Victoria in Kenya Pathammavong, O., (1971). Epidemiological and Tanzania—A cross-sectional study. PLoS study of Schistosomiasis japonica on Khong neglected tropical diseases, 12(3), e0006373. Island, southern Laos. South East Asian Journal Othman, A. A., & Soliman, R. H., (2015). of Tropical Medicine and Public Health, 2(3), Schistosomiasis in Egypt: A never-ending story? 365-374. Acta tropica, 148, 179-190. Sripa, J., Laha, T., & Sripa, B., (2017). Parker, J., Guo, D., & Hodges, R., (1986). New Characterization and functional analysis of hydrophilicity scale derived from high- fatty acid binding protein from the carcinogenic performance liquid chromatography peptide liver fluke, Opisthorchis viverrini. Parasitology retention data: correlation of predicted surface international, 66(4), 419-425. residues with antigenicity and X-ray-derived Thetiot‐Laurent, S. A. L., Boissier, J., Robert, accessible sites. Biochemistry, 25(19), 5425- A., & Meunier, B., (2013). Schistosomiasis 5432. chemotherapy. Angewandte Chemie International Rahmani, A., Baee, M., Rostamtabar, M., Karkhah, Edition, 52(31), 7936-7956. A., Alizadeh, S., Tourani, M., & Nouri, H. R., Vale, N., Gouveia, M. J., Rinaldi, G., Brindley, P. (2019). Development of a conserved chimeric J., Gärtner, F., & da Costa, J. M. C., (2017). vaccine based on helper T-cell and CTL epitopes Praziquantel for schistosomiasis: single- for induction of strong immune response against drug metabolism revisited, mode of action, Schistosoma mansoni using immunoinformatics and resistance. Antimicrobial agents and approaches. International journal of biological chemotherapy, 61(5) macromolecules, 141, 125-136. Voge, M., Bruckner, D., & Bruce, J. I., (1978). Roy, A., Kucukural, A., & Zhang, Y., (2010). Schistosoma mekongi sp. n. from man and I-TASSER: a unified platform for automated animals, compared with four geographic strains protein structure and function prediction. Nature of Schistosoma japonicum. The Journal of protocols, 5(4), 725-738. parasitology, 577-584. Saha, S., & Raghava, G. P. S., (2006). Prediction of Waghmare, S., & Chavan, R., (2012). Prediction continuous B‐cell epitopes in an antigen using of Major Histocompatibility Complex Binding recurrent neural network. Proteins: Structure, Peptides and Epitopes from Fatty-Acid-Binding Function, and Bioinformatics, 65(1), 40-48. Protein of the Human Blood Fluke Schistosoma Salachan, P,V., Jaroenlak, P., Thitamadee, S., Japonicum. Metabolomics, 2(113), 2153- Itsathitphaisarn, O., Sritunyalucksana, K., 0769.1000113. (2017). Laboratory cohabitation challenge model Webster, B. L., Diaw, O. T., Seye, M. M., Faye, D. for shrimp hepatopancreatic microsporidiosis S., Stothard, J. R., Sousa- Figueiredo, J. C., & (HPM) caused by Enterocytozoon hepatopenaei Rollinson, D., (2013). Praziquantel treatment of (EHP). BMC Vet Res; 13(1):9. school children from single and mixed infection TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 55
12. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II foci of intestinal and urogenital schistosomiasis Schistosoma japonicum after treatment with along the Senegal River Basin: monitoring praziquantel in Poyang lake region, China. The treatment success and re-infection patterns. Acta Southeast Asian journal of tropical medicine and tropica, 128(2), 292-302. public health, 25(1), 163-169. Welling, G. W., Weijer, W. J., van der Zee, R., Yang, J., & Zhang, Y., (2015). I-TASSER server: new & Welling-Wester, S., (1985). Prediction of development for protein structure and function sequential antigenic regions in proteins. FEBS predictions. Nucleic acids research, 43(W1), letters, 188(2), 215-218. W174-W181. Zhang, Y. (2008). I-TASSER Wu, Z., Shaoji, Z., Pan, B., Hu, L., Wei, R., Gao, server for protein 3D structure prediction. BMC Z., Li, J., & Uwe, B., (1994). Reinfection with bioinformatics, 9(1), 40. 56 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021
13. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II MOLECULAR CHARACTERIZATION AND TISSUE DISTRIBUTION OF FABP (FATTY ACID BINDING PROTEIN) IN SCHISTOSOMA MEKONGI Hong Thi Cam Do1*, Wanwisa Peonsamut2, Manaw Sangfuang2, Yanin Limpanont3, Charoonroj Chotwiwattanakun4, Prasert Sobhon5, Narin Preyavichyapugdee2 ABSTRACT Fatty acid-binding protein (FABP) belongs to a large family of intracellular lipid-binding proteins. It has a low molecular weight (14-15 kDa) and plays a functional role in the synthesis of the outer cell membrane that is continually shedding off. It is one of the six candidate vaccine antigens that was selected by the WHO to study against schistosomiasis, with various degrees of therapeutic effects. The cDNA encoding SmekFABP of adult Schistosoma mekongi was cloned and sequenced. The nucleotide sequence of SmekFABP was 582 bp in length. The nucleotide sequence of SmekFABP showed an open reading frame encoding FABP containing 132 amino acids. The SmekFABP amino acid sequences showed the highest degree of identity with the S. japonicum (GenBank: AAA64426) at 95.4%. The identity of SmekFABP amino acid sequences with other schistosomes (S. mansoni, and S. haematobium showed at 91.7 and 90.2 respectively. The expected molecular weight of rSmekFABP determined from its constituent amino acids is 14.82 kDa and the predicted molecular weight of rSmekFABP protein with histidine tag is 15.5 kDa. In this study, we got one major band at 26 kDa, that could be rSmekFABP that form a complex protein and the faint band that was 15.5 kDa, which is possible to be the rSmekFABP. A high degree of similarity and identity of S. mekongi with S. japonicum FABP in both nucleic and amino acid, and similarity in localization of worm tissue, indicates that they share a common ancestor. The low degree of conservation observed from amino acid sequences of mammalian hosts could reveal its applicable for using as the vaccine candidate against the schistosome infection which may not interfere with the host’s FABP molecule during the vaccination. Based on bioinformatic approach, one immunogenic epitope was predicted by five programs (Hopp & Woods; Welling, Parker, B-EpiRred and ABCpred), it was 87-DSESKITQTQKDAKN-101, According to previous researches, this peptide fragment has a potential immunogenic to CTL (Cytotoxic T lymphocyte) and Major Histocompatibility Complex – I (MHC-I) in immune system of mammalian’s host. Keywords: FABP, Schistosoma mekongi, immunogenic, vaccination, CTL, MHC-I (Major Histocompatibility Complex –I). Người phản biện: TS. Ngô Huỳnh Phương Thảo Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước Ngày nhận bài: 28/5/2021 Ngày nhận bài: 28/5/2021 Ngày thông qua phản biện: 15/6/2021 Ngày thông qua phản biện: 10/6/2021 Ngày duyệt đăng: 25/6/2021 Ngày duyệt đăng: 25/6/2021 1 Research Institute for Aquaculture No. 2. 2 Silpakorn University, Phetchaburi - Thailand 3 Applied Malacology Unit, Faculty of Tropical Medicine, Mahidol University, Bangkok, Thailand 4 Mahidol University, Nakhonsawan Campus, Nakhonsawan, Thailand 5 Department of Anatomy, Faculty of Science, Mahidol University, Bangkok, Thailand * Email: camhong573@gmail.com TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 19 - THÁNG 6/2021 57