Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn edwardsiella ictaluri lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra (pangasianodon hypophthalmus)

Nội dung text: Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn edwardsiella ictaluri lên các chỉ tiêu huyết học của cá tra (pangasianodon hypophthalmus)

1. BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM - HỘI NGHỊ KHOA HỌC QUỐC GIA LẦN THỨ 4 DOI: 10.15625/vap.2020.00083 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri LÊN CÁC CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Trần Thị Phương Dung*, Nguyễn Hồ Phương Uyên Tóm tắt: Đề tài được thực hiện với mục tiêu đánh giá sự biến động về huyết học và khả năng diệt khuẩn của huyết thanh trên cá Tra giống (45-50 g) khi nhiễm vi khuẩn Edwarsiella ictaluri sau 2-4 tuần. Vi khuẩn Edwarsiella ictaluri là tác nhân gây chết cá Tra giống chiếm tỉ lệ 51,2%. Kết quả phân tích các chỉ tiêu huyết học cho thấy số lượng hồng cầu giảm mạnh ở cá bị bệnh mủ gan (p < 0,05), đồng thời có sự xuất hiện của hồng cầu không nhân và hồng cầu thoái hóa. Các loại bạch cầu lympho, bạch cầu mono hay bạch cầu trung tính đều biến động theo hướng giảm ở thời điểm sau hai tuần cá được cảm nhiễm vi khuẩn nhưng tăng trở lại sau bốn tuần có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh cá bệnh cao hơn cá khỏe. Từ khóa: Edwardsiella ictaluri, Pangasianodon hypophthalmus, huyết học, miễn dịch. 1. MỞ ĐẦU Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một trong những loài cá da trơn nước ngọt có giá trị kinh tế cao được nuôi phổ biến ở Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) (Phan và nnk., 2009). Theo thống kê từ Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản Việt Nam (VASEP), trong 9 tháng đầu năm 2018 kim ngạch xuất khẩu cá Tra đến 127 quốc gia trên thế giới đạt 1,6 tỉ USD, tăng 24% so với cùng kỳ năm 2017. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, việc sản xuất và tiêu thụ cá Tra đang phải đối mặt với nhiều khó khăn và thách thức do giá cả bấp bênh, thị trường xuất khẩu không ổn định và việc thâm canh hóa với mật độ nuôi cao đã làm cho bệnh trên cá xảy ra thường xuyên hơn (Le & Cheong, 2010). Bệnh phổ biến và nguy hiểm trên cá Tra giống ở ĐBSCL từ năm 2007 là bệnh mủ gan (chiếm 51,2%) (Lý Thị Thanh Loan, 2008). Hiện nay, các nghiên cứu về vaccine nhằm tăng cường khả năng đề kháng cao, góp phần thúc đẩy nghề nuôi thủy sản bền vững và hiệu quả hơn về kinh tế cũng như môi trường. Nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm sinh lí, sinh hóa, khả năng gây bệnh, độc lực của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cũng như sự biến đổi mô học do vi khuẩn này gây ra đã được công bố trên các đối tượng cá Tra với các kích cỡ khác nhau làm nền tảng cho việc tạo vaccine. Tuy nhiên, thông tin về sự biến đổi các chỉ số huyết học và khả năng miễn dịch của cá Tra bị nhiễm vi khuẩn E. ictaluri giai đoạn cá giống (45-50 g) rất ít và rời rạc. Nghiên cứu này nhằm đánh giá tổng quát sự biến động các tế bào máu và kháng thể đặc hiệu bảo vệ cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) chống lại vi khuẩn E. ictaluri khi nhiễm bệnh ngoài tự nhiên. Vì vậy, nghiên cứu về ảnh hưởng của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri lên các chỉ tiêu huyết học và khả năng tiêu diệt vi khuẩn huyết thanh của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) giai Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh *Email: dungttp@hcmue.edu.vn
2. PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 671 đoạn cá giống từ 45-50 g trong thời gian mắc bệnh dài từ 2-4 tuần được thực hiện góp phần cung cấp thêm thông tin làm cơ sở cho việc chẩn đoán và phòng bệnh bệnh mủ gan một cách đầy đủ hơn. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu Cá Tra giống (Pangasianodon hypophthalmus) có kích cỡ khoảng 45-50 g/con. Cá được nuôi ổn định 3 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm để cho cá quen với điều kiện sống trong bể. Cá được nuôi trong môi trường nước pH=7-7,5, nhiệt độ duy trì ở mức nhiệt độ phòng tương ứng nhiệt độ nước 27-28 oC. Cá được cho ăn thức ăn công nghiệp 3 lần/ngày vào lúc 7 h, 12 h, 17 h. Chọn cá bố trí thí nghiệm có kích thước tương đối đồng đều, khỏe mạnh, linh hoạt và da sáng bóng. Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm với 3 nghiệm thức (NT): (i) NT1 cá tiêm nước muối sinh lí; (ii) NT2 cá tiêm vi khuẩn nồng độ 104 CFU/mL; (iii) NT3 cá tiêm vi khuẩn nồng độ 105 CFU/mL. Mỗi NT 15 con (lặp lại 3 lần). Thu mẫu máu 15 cá thể/NT qua 3 thời điểm: (i) Lần 1: trước cảm nhiễm; (ii) Lần 2: sau khi tiêm cá với vi khuẩn hay nước muối sinh lí 2 tuần; (iii) Lần 3: sau khi tiêm cá với vi khuẩn hay nước muối sinh lí 4 tuần. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp nhuộm vi khuẩn gram âm mẫu phết mô Phương pháp được mô tả bởi Lưu Thị Thanh Trúc (2014): phết mẫu mô chứa vi khuẩn lên lam, cố định bằng đèn cồn, sau đó cho lần lượt các dung dịch Crustal violet (30 giây), lugon (60 giây), ethanol (15-30 giây), safranin (60-80 giây). Tại mỗi bước đều rửa bằng nước cất 5 giây. Sau đó đưa lam lên kính quan sát ở vật kính (X40). Phương pháp nhuộm HE mẫu mô Phương pháp được mô tả bởi Lưu Thị Thanh Trúc (2014): cố định mẫu bằng formalin 10%. Sau đó cắt tỉa mẫu, khử nước, làm trong mẫu và ngấm paraffin. Sau đó tiến hành đúc khối mẫu, cắt mẫu. Nhuộm mẫu bằng Mayer’s Hematoxylin và Eosin (HE). Sau đó đưa lam lên kính quan sát ở vật kính (X40). Phương pháp định lượng số lượng hồng cầu Phương pháp được mô tả bởi Natt & Herrick (1952) có hiệu chỉnh: lấy máu cá từ động mạch chủ đuôi bằng kim tiêm 1 mL tiệt trùng. Dùng ống hút pha loãng hồng cầu hút máu lên đúng vạch 0,5. Đưa đầu ống pha loãng vào dung dịch pha loãng hồng cầu (Hayems), hút từ từ đến vạch 101, vừa hút vừa xoay nhẹ ống pha loãng. Ngừng hút khi đến vạch 101, rút ống pha loãng ra khỏi dung dịch pha loãng, đặt ngón trỏ vào đầu của ống pha loãng, tháo dây hút ra. Lắc ống pha loãng trong 3 phút. Bỏ 3-4 giọt đầu, lau khô đầu ống pha loãng, Cho hỗn hợp dung dịch lan tỏa vào đầy buồng đếm, để yên trong 2 phút. Đếm hồng cầu 4 ô lớn (1 ô lớn có 16 ô nhỏ) ở 4 góc của buồng đếm và 1 ô ở trung tâm buồng đếm. Công thức tính mật độ hồng cầu: N1 = A x (4000 : 80) x 200 = A x 10000 (số hồng cầu đếm được trong 5 ô lớn (80 ô nhỏ) là A).
3. 672 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Phương pháp định lượng số lượng bạch cầu tổng Phương pháp được mô tả bởi Hrubec et al., (2000) như sau: nhỏ một giọt máu cách đầu lam kính 1 cm. Một tay giữ lam kính, tay còn lại cầm lam kéo, nghiêng 45o tiếp xúc cạnh ngắn vào giọt máu để cho máu lan tỏa theo cạnh này, khi giọt máu đã được chia đều, đẩy nhanh và đều lam kéo theo chiều dài của lam nằm ngang. Cố định tiêu bản bằng cách tay trái cầm tiêu bản nghiêng 30o, tay phải cầm pipet nhỏ 3 - 4 giọt cồn tuyệt đối lên phần đầu của tiêu bản, nghiêng tiêu bản cho cồn chảy hết về đuôi của tiêu bản máu. Nhỏ giọt dung dịch thuốc nhuộm Giemsa phủ kín diện tích máu, để 15 - 20 phút sau đó rửa tiêu bản. Đếm tổng số 1.500 tế bào hồng cầu và bạch cầu trên mẫu nhuộm. TBC = (Số bạch cầu trong 1.500 tế bào × R) / Số hồng cầu trong 1.500 tế bào (TBC là số lượng bạch cầu trong 1 mm3 máu. R là số lượng hồng cầu trong 1 mm3 máu. Phương pháp định lượng số lượng từng loại bạch cầu Phương pháp được mô tả bởi Hrubec et al., (2000): đếm tổng số bạch cầu bằng 100 tế bào. Mật độ từng loại bạch cầu (tb/mm3) = (số lượng mỗi loại BC × mật độ TBC)/100 Phương pháp xác định khả năng diệt khuẩn của huyết thanh Phương pháp được mô tả bởi Từ Thanh Dung và nnk. (2013) như sau: Dùng kim tiêm 1 mL để lấy máu và cho vào ống eppendorf 1,5 mL, để yên và giữ lạnh ở 4 oC trong vòng 2 - 3 giờ. Tiến hành li tâm 6.000 vòng/phút trong 5 phút. Sau khi li tâm, lấy phần huyết thanh cho vào ống eppendorf sạch và tiến hành xác định hiệu giá kháng thể hoặc trữ lạnh (-20 oC). Vi khuẩn E. ictaluri được bất hoạt bằng formol 2% và giữ trong ngăn mát tủ lạnh 24 giờ. Sau đó, dung dịch vi khuẩn được li tâm 3500 vòng/phút trong 15 phút để rửa sạch formol bằng nước muối sinh lí tiệt trùng, thao tác được lặp lại 2 - 3 lần. Hiệu giá kháng thể trong huyết thanh được xác định bằng phản ứng vi ngưng kết kháng nguyên - kháng thể trên các đĩa nhựa (microplate) 96 giếng. Cho 25 µL huyết thanh vào giếng số 1 và 2. Từ giếng số 2 trở đi cho vào mỗi giếng 25 µL nước muối sinh lí. Trộn đều huyết thanh với nước muối sinh lí ở giếng 1, hút 25 µL chuyển sang giếng số 2 rồi trộn đều, tiếp tục hút 25 µL ở giếng số 2 chuyển sang giếng 3 rồi trộn đều. Tiếp tục làm như vậy cho đến giếng cuối cùng (ở giếng 12 lấy ra 25 µL bỏ đi). Cho 25 µL kháng nguyên (vi khuẩn E. ictaluri bị bất hoạt) vào mỗi giếng rồi trộn đều. Để yên 4 - 5 giờ ở nhiệt độ phòng rồi đọc kết quả. Dương tính (+): đáy giếng tạo thành một lớp ngưng kết trải rộng. Âm tính (-): ở đáy giếng chỉ có một chấm tròn nhỏ màu trắng. 2.3. Xử lí số liệu Số liệu được xử lí dựa trên một nhân tố bằng cách sử dụng phần mềm MS Excel nhập và xử lí số liệu. Các số liệu trung bình được trình bày ở dạng TB ± SD. Phân tích thống kê bằng phương sai một yếu tố mẫu đo lường có lặp lại (ONE WAY ANOVA). Sử dụng kiểm định so sánh đối chiếu Duncan được dùng để so sánh sự khác biệt giữa các mức của yếu tố thí nghiệm. Mức xác suất p < 0,05 được chấp nhận như tiêu chuẩn đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Tất cả các phân tích thống kê được thực hiện bằng phần mềm IBM SPSS Statistics version 22.0.
4. PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 673 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn E. ictaluri đến hình thái nội quan và mô học của cá Tra Các đặc điểm về hình thái nội quan và mô học cá Tra nhiễm vi khuẩn E. ictaluri qua nghiên cứu này trên cá Tra giống giai đoạn 45 - 50 g cho thấy vi khuẩn xâm nhập vào các nội quan sau 12 h cảm nhiễm; khi bị xâm bởi nhiễm vi khuẩn E. ictaluri thì các cơ quan như gan, thận và tỳ tạng xuất hiện các biểu hiện đặc trưng cho bệnh mủ gan như xung huyết, xuất huyết, xuất hiện đốm trắng mủ từ 1 - 3 mm sau 3 ngày gây nhiễm và hoại tử các nội quan khi quan sát mô học khi nhuộm HE dưới kính hiển vi (Hình 1). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Suanyuk et al., (2013) và Soto (2012) với các bệnh tích điển hình do vi khuẩn Edwarsiella ictaluri. a b c d Hình 1. a. Nội quan cá với nhiều đốm trắng; b. Vi khuẩn xâm nhập vào mô cá sau 12 h (nhuộm Gram âm vệt phết mẫu mô); c. Tổn thương xuất huyết và nghẽn cầu thận trên mô thận sau 72 h (nhuộm HE); d. Tổn thương xuất huyết trên mô gan sau 72 h (X40) (nhuộm HE) 3.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn E. ictaluri đến số lượng hồng cầu của cá Tra Bên cạnh hồng cầu trưởng thành với hình dạng bình thường với cấu trúc hình cầu, ở những bể cá được cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri trong đợt thu mẫu lần 2 và 3 còn ghi nhận được sự xuất hiện của nhiều dạng hồng cầu bất thường như hồng cầu không nhân và hồng cầu bị thoái hóa (Hình 2). a b c Hình 2. a. Vi khuẩn bao quanh HC sau 6 h cảm nhiễm; b. HC mất nhân sau 2 tuần cảm nhiễm; c. HC thoái hóa sau 2 tuần cảm nhiễm (X40)
5. 674 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Trong những nghiên cứu của Nguyễn Thị Thúy Liễu và nnk. (2011) cũng ghi nhận được sự xuất hiện của các dạng hồng cầubất thường ở đối tượng cá Tra bị nhiễm bệnh. Bảng 1. Sự biến động số lượng hồng cầu (x106 TB/mm3) của cá Tra qua các lần thu mẫu ở các mật độ vi khuẩn E. ictaluri khảo sát Thời gian Đối chứng NT1 (104 CFU/ml) NT2 (105 CFU/ml) Lần 1 2,071 ± 0,134xa 2,057 ± 0,113xa 2,099 ± 0,123xa Lần 2 2,103 ± 0,124xa 1,279 ± 0,089yb 1,284 ± 0,090yb Lần 3 2,131 ± 0,129xa 1,310 ± 0,068yb 1,301 ± 0,075yb Các chữ cái x, y trong cùng một cột chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p 0,05) chứng tỏ trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm không có sự ảnh hưởng của các tác nhân ngoại cảnh làm thay đổi các chỉ số huyết học; (2) cá sau khi cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri ở cả hai NT 104 và 105 CFU/m đều có số lượng hồng cầu thu ở lần 2, lần 3 giảm có ý nghĩa thống kê (p 0,05) và đạt giá trị trung bình là (13,773 ± 2,815)x104 TB/mm3 đối với NT đối chứng, NT1 và NT2 lần lượt là (13,046 ± 2,350)x104 TB/mm3 và (12,633 ± 2,431)x104 TB/mm3; (ii) số lượng tổng BC ở NT đối chứng qua cả 3 lần thu mẫu đều không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) chứng tỏ trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm, sự biến động của số lượng tổng bạch cầu không chịu ảnh hưởng của các tác nhân ngoại cảnh; (iii) ở các NT được cảm nhiễm vi khuẩn, lượng
6. PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 675 tổng bạch cầu đều giảm ở lần 2 và bắt đầu tăng trở lại vào lần 3 với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) và tổng BC ở NT2 và NT3 qua lần lấy mẫu 2 và 3 đều thấp hơn NT1 đối chứng. Kết quả này phù hợp nghiên cứu Benli & Yildiz (2004) khi cảm nhiễm vi khuẩn trên cá đã kết luận rằng khoảng vài ngày đầu sau khi được cảm nhiễm vi khuẩn, tổng lượng bạch cầu của cá sẽ tăng cao để chống lại sự xâm nhập và tấn công của vi khuẩn. Bên cạnh đó, một số nghiên cứu gần đây cũng đã ghi nhận rằng số lượng tổng bạch cầu ở cá bệnh khi thu mẫu ở những giai đoạn khác nhau sẽ có sự biến động khác nhau. Ngoài ra, nghiên cứu của Từ Thanh Dung (2010) kết luận rằng mật độ tổng bạch cầu của cá Tra có sự thay đổi rõ rệt tùy thuộc vào mức độ nhiễm bệnh của cá. Dựa trên những cơ sở và nghiên cứu trên, có thể dự đoán số lượng tổng bạch cầu của cá Tra ngay sau khi được cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri có tăng so với cá khỏe để chống lại sự xâm nhiễm và tấn công của vi khuẩn, nhằm bảo vệ cơ thể. Tuy nhiên ở thời điểm thu mẫu lần 2, số lượng tổng bạch cầu có sự suy giảm mạnh có thể giải thích do chính sự tác động của vi khuẩn E. ictaluri lên cấu trúc mô của một số cơ quan, đặc biệt là thận trước và tỳ tạng trong một thời gian dài từ đó làm biến đổi cấu trúc và suy giảm chức năng tạo máu của những cơ quan này (Brason, 1993). Theo nghiên cứu về đặc điểm mô bệnh học của cá Tra bị bệnh mủ gan của Quách Văn Cao Thi (2017), ở ngày thứ 2 sau khi cảm nhiễm quan sát mô thận của cá thấy đã bắt đầu xuất hiện hiện tượng xung huyết, xuất huyết dẫn đến thận mất đi những chức năng quan trọng và làm suy giảm chức năng tạo hồng cầu, bạch cầu, không còn khả năng tạo kháng thể và thực bào. Đây chính là những nguyên nhân làm cho số lượng hồng cầu và tổng bạch cầu trong hai NT được cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri đều giảm đáng kể ở lần thu mẫu sau hai tuần cảm nhiễm. Tuy nhiên, ở lần thu mẫu sau bốn tuần cá được cảm nhiễm vi khuẩn, số lượng hồng cầu và bạch cầu đều có sự tăng nhẹ so với lần thu mẫu trước có thể giải thích do vai trò đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể nguyên phát (Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương, 2007). 3.4. Ảnh hưởng của vi khuẩn E. ictaluri đến số lượng các loại bạch cầu của cá Tra Trong quá trình phân tích định loại và định lượng tế bào bạch cầu, đã ghi nhận được sự xuất hiện của các loại bạch cầu như: bạch cầu lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính, không quan sát được bạch cầu ưa bazơ, bạch cầu ưa axit rất hiếm gặp nên không thể định lượng (Hình 3). a b c Hình 3. a. BC Lympho; b. BC mono; c. BC trung tính (mũi tên) (X40)
7. 676 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM Nghiên cứu về sự biến động của các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu trên cá Tra nuôi nhiễm vi khuẩn E. ictaluri của Nguyễn Thị Thúy Liễu và nnk. (2011) cũng cho kết quả không quan sát được bạch cầu ưa axit và bạch cầu ưa bazơ. 3.5. Ảnh hưởng của vi khuẩn E. ictaluri đến tỉ lệ các loại bạch cầu của cá Tra Bảng 3. Sự biến động tỉ lệ các lọai bạch cầu (x106 TB/mm3) của cá Tra qua các lần thu mẫu ở các mật độ vi khuẩn E. ictaluri khảo sát NT ĐỐI CHỨNG NT1 (104 CFU/ml) NT2 (105 CFU/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Bạch cầu Lympho 11,164 10,799 10,619 10,539 3,181 5,399 10,394 3,511 5,670 ± ± ± ± ± ± ± ± ± 2,322xa 2,633xa 2,135xa 1,829xa 0,775yb 0,721zb 2,208xa 0,684yb 0,926zb Neutro 1,253 1,079 1,048 1,145 0,748 1,157 1,043 0,586 0,964 ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0,435xa 0,286xa 0,338xa 0,480xa 0,261yb 0,491xa 0,387xa 0,231yb 0,246xa Mono 1,323 1,269 1,331 1,365 0,958 1,581 1,189 0,755 1,201 ± ± ± ± ± ± ± ± ± 0,370xa 0,348xa 0,291xa 0,357xa 0,217yb 0,290xb 0,248xa 0,199yb 0,188xa Các chữ cái a, b,c, trong cùng một hàng chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05. Các chữ cái x,y trong cùng một cột chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p< 0,05. Dựa vào kết quả số lượng từng loại BC phân tích ở Bảng 3, nhìn chung các loại BC lympho, BC mono hay BC trung tính đều biến động theo hướng giảm ở thời điểm sau hai tuần cá được cảm nhiễm vi khuẩn nhưng tăng trở lại sau bốn tuần. Trong 2 NT được cảm nhiễm vi khuẩn so với NT đối chứng, tỉ lệ các loại BC lại có sự biến động giảm sau 2 tuần và vào thời điểm bốn tuần có sự bắt đầu tăng lại của các loại bạch cầu. Sự thay đổi tỉ lệ các loại BC trước và sau khi được cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri có thể được giải thích do BC neutro có vai trò trong phản ứng viêm, là loại BC đầu tiên đến vị trí vi khuẩn xâm nhập với số lượng lớn, ngoài ra còn có khả năng thực bào. Do đó sự tăng nhẹ tỉ lệ BC trung tính cho thấy tại thời điểm thu mẫu sau hai tuần cá được cảm nhiễm vi khuẩn hoạt động của hệ bạch huyết đang được gia tăng để tiêu diệt các vi sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể. BC mono là tế bào tham gia vào hệ thống miễn dịch không đặc hiệu với vai trò thực bào tiêu diệt vi khuẩn và đặc biệt là khả năng trình diện kháng nguyên để thực hiện bước khởi đầu của quá trình đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Sau hai tuần cảm nhiễm vi khuẩn, tỉ lệ BC mono có gia tăng nhẹ nhằm giúp hệ thống miễn dịch nhận biết được kháng nguyên, sản xuất kháng thể chuyên biệt. Mặt khác, BC lympho có vai trò quan trọng trong miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào nên sự giảm nhẹ tỉ lệ BC lympho có thể do sự xâm nhiễm của vi khuẩn E. ictaluri vào cơ thể cá làm suy giảm hệ miễn dịch và tình trạng này kéo dài trong hai tuần gây ra hiện tượng đó. Sau 4 tuần vi khuẩn bị suy yếu nên các loại bạch cầu tăng để sản xuất kháng thể tham gia đáp ứng miễn dịch. Kết quả này phù hợp với hàm lượng kháng thể tăng lên mãnh liệt để đạt cực đại khoảng ngày thứ 20 - 30 sau khi tiêm kháng nguyên (Đặng Thị Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương, 2007).
8. PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 677 3.6. Xác định hiệu giá kháng thể của cá Tra sau bốn tuần cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri Kháng thể huyết thanh thường xuất hiện ngay trước thời điểm số lượng tương bào đạt cực đại khoảng ngày thứ 10-15 và hàm lượng kháng thể tăng lên mãnh liệt để đạt cực đại khoảng ngày thứ 20-30 sau khi tiêm kháng nguyên (Đặng Hoàng Oanh và Đoàn Nhật Phương, 2007). Dựa trên cơ sở đó thí nghiệm gây đáp ứng miễn dịch cho cá Tra được thực hiện ở thời điểm sau bốn tuần kể từ ngày cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri cho cá để đảm bảo hiệu giá kháng thể thu được đạt cực đại. Hiệu giá kháng thể 3 2.47 2.5 1.8 2 1.5 1 0.5 0.27 Hiệu giá kháng Hiệugiá kháng thể 0 Đối chứng NT1 NT2 Mật độ vi khuẩn E.ictaluri (CFU/ml) khảo sát Hình 4. Biến động hiệu giá kháng thể của cá Tra qua các lần thu mẫu ở các mật độ vi khuẩn E. ictaluri (CFU/ml) khảo sát Kết quả phân tích hiệu giá kháng thể cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) giữa các NT sau bốn tuần cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. Cụ thể, hiệu giá kháng thể trung bình của cá ở NT đối chứng có giá trị là 0,27 ± 0,57, chứng tỏ hệ thống miễn dịch ở nhóm cá đối chứng chưa được kích thích nên lượng kháng thể rất thấp. Ở các NT được cảm nhiễm vi khuẩn thì hiệu giá kháng thể trung bình tăng rõ rệt so với NT đối chứng, cụ thể, ở NT1 cá được cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri mật độ 104 CFU/mL thì hiệu giá kháng thể trung bình ghi nhận được là 1,8 ± 0,83, cao gấp 6,7 lần so với NT đối chứng. Ở NT2 cá được cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri mật độ 105 CFU/mL thì hiệu giá kháng thể trung bình ghi nhận được là 2,47 ± 0,72, cao gấp 1,4 lần so với NT1 và gấp 9,15 lần so với NT đối chứng và sự sai khác hiệu giá kháng thể ở cả ba NT đều có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Kết quả trên còn cho thấy hiệu giá kháng thể trung bình tăng tỉ lệ theo mật độ vi khuẩn cảm nhiễm cho cá. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Bùi Quang Tề (2004), mức độ sản xuất kháng thể trong đáp ứng miễn dịch nguyên phát có tương quan thuận với liều lượng kháng nguyên đưa vào cơ thể. Vì vậy, trên cá Tra trong 3 NT khảo sát thì NT tiêm vi khuẩn mật độ 105 CFU/mL thì tạo kháng thể tốt nhất cho việc đáp ứng miễn dịch trong 4 tuần trên cá giai đoạn 45 - 50 g. 4. KẾT LUẬN Kết quả phân tích các chỉ tiêu huyết học cho thấy số lượng hồng cầu giảm mạnh ở cá bị bệnh mủ gan (p< 0,05), đồng thời có sự xuất hiện của hồng cầu không nhân và hồng cầu
9. 678 BÁO CÁO KHOA HỌC VỀ NGHIÊN CỨU VÀ GIẢNG DẠY SINH HỌC Ở VIỆT NAM thoái hóa. Các loại BC lympho, BC mono hay BC trung tính đều biến động theo hướng giảm ở thời điểm sau hai tuần cá được cảm nhiễm vi khuẩn nhưng tăng trở lại sau bốn tuần có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Khả năng diệt khuẩn của huyết thanh cá bệnh cao hơn cá khỏe. Nghiên cứu này là cơ sở cho các nghiên cứu khác khi tiêm vaccine cho cá ở dải nồng độ rộng hơn và khảo sát trong khoảng thời gian dưới 2 tuần vì qua hai tuần các tế bào bạch cầu bắt đầu giảm làm giảm khả năng miển dịch trên cá Tra giai đoạn 46 - 50 g. Tuy nhiên, việc tạo và duy trì kháng thể trong 4 tuần khi cá được tiêm vi khuẩn rất có ý nghĩa trong việc tạo vaccine giúp cho việc tăng khả năng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cho cá. TÀI LIỆU THAM KHẢO Benli A. C. K., H. Y. Yildiz, 2004. Blood parameters in Nile tilapia (Oreochromis niloticus L.) spontaneously infected with Ewardsiella tarda. Short communication, Aquaculture Research, pp. 1388-1390. Branson E., 1993. Basic anatomy and physiology. Abbott Laboratories, North Chicago, USA, 447pp. Từ Thanh Dung, Trần Hoa Cúc, Nguyễn Hoàng Nhật Uyên, Mã Lê Diễm Trang, 2013. Khả năng đáp ứng miễn dịch của cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) chống lại Edwardsiella ictaluri. Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ, 26 (2013): 269-276. Từ Thanh Dung, Nguyễn Thị Tiên và Nguyễn Anh Tuấn, 2012. Nghiên cứu tác nhân gây bệnh trắng đuôi trên cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) và giải pháp phòng trị. Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ, trang 136-145. Ferguson H.W., J.F. Turnbull, A. Shin, K. Thompson, T.T. Dung, M. Crumlish, 2001. Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage), from the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases, 24: 509-513. Hrubec T. C., J. L. Cardinale, S. A.Smith, 2000. Hematology and plasma chemistry reference intervals for cultured Tilapia (Oreochromis hybrid ). Vet. Clin. Pathol., 29:7-12 Le T. C., Cheong F., 2010. Perceptions of risk and risk management in Vietnamese catfish farming: An empirical study. Aquaculture Economics and Management, 14: 282-314. Nguyễn Thị Thúy Liễu, Bùi Thị Bích Hằng, Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011. Đánh giá các yếu tố miễn dịch không đặc hiệu trên cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi trong ao bị bệnh mũ gan. Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ, 17a: 20-29. Lí Thị Thanh Loan, 2008. Báo cáo tổng kết nhiệm vụ thường xuyên “Quan trắc, cảnh báo môi trường và dịch bệnh thủy sản một số vùng nuôi thủy sản các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long và miền Đông Nam Bộ”. Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. Natt M. P., Herrick C. A., 1952. A new blood diluent for counting erythrocytes and leukocytes of the chicken. Poult Sci., 31: 735-738. Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, 2007. Giáo trình Miễn dịch học động vật thủy sản. Nxb. Trường Đại học Cần Thơ. Phan L. T., Tam B. M., Thuy N. T. T., Gooley G. J., Ingram B. A. , Hao N. V. , Phuong N. T., De Silva S. S., 2009. Current status of farming practices of striped catifish, Pangasianodon hypophthalmus in the Mekong Delta, Vietnam. Aquaculture, 296: 227-236. Soto E., 2012. Edwardsiella ictaluri as the Causative Agent of Mortality in Cultured Nile Tilapia. Journal of Aquatic Animal Health, 24(2): 81-90.
10. PHẦN II. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG SINH HỌC PHỤC VỤ ĐỜI SỐNG VÀ PHÁT TRIỂN XÃ HỘI 679 Suanyuk N., Rogge M., Thune R., Watthanaphiromsakul M., Champhat N., Wiangkum, W., 2013. Mortality and pathology of hybrid catfish, Clarias macrocephalus (Günther) × Clarias gariepinus (Burchell), associated with Edwardsiella ictaluri infection in southern Thailand. J. Fish Dis., 37(4): 385-95. Bùi Quang Tề, 2006. Bệnh học thủy sản. Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản I. Quách Văn Cao Thi, 2017. Nghiên cứu đặc điểm bệnh học và cơ chế đa kháng thuốc của hai loài vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi thâm canh ở đồng bằng sông Cửu Long. Luận án tiến sĩ Chuyên ngành vi sinh vật, Đại Học Cần Thơ. Lưu Thị Thanh Trúc, 2014. Thực hành chẩn đoán bệnh trên động vật thủy sản. Nxb. Nông nghiệp. STUDYING THE EFFECTIVENESS OF Edwardsiella ictaluri Bacteria ON HEMATOLOGICAL INDICATORS OF STRIPED CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) Tran Thi Phuong Dung*, Nguyen Ho Phuong Uyen Abtracts: This study aimed to evaluate the differences in haematological parameters and ability to kill bacteria using serum from fish (45-50 g) infected by Edwardsiella ictaluri bacteria at 2-3 weeks. Edwarsiella ictaluri bacteria accounts for 51.2% of Tra catfish deaths. Results from haematological analysis revealed a significant reduction (p < 0.05) in the total number of red blood cells, the presence of non-nuclear red cells and degraded red blood cells in infected fish. Both mono and neutral lymphocytes fluctuated for two weeks after the fish became infected, but generally trended downward. However, lymphocyte levels significantly increased again after 4 weeks. The ability to kill bacteria in the serum of diseased fish was higher than in healthy fish. Keywords: Edwardsiella ictaluri, Pangasianodon hypophthalmus, haematology, immune response. Ho Chi Minh City University of Education *Email: dungttp@hcmue.edu.vn