Kết quả bước đầu phát triển bộ chỉ thị microsatellite mới từ hệ gen cá tra (pangasianodon hypophthalmus) bằng công cụ tin sinh học

Nội dung text: Kết quả bước đầu phát triển bộ chỉ thị microsatellite mới từ hệ gen cá tra (pangasianodon hypophthalmus) bằng công cụ tin sinh học

1. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU PHÁT TRIỂN BỘ CHỈ THỊ MICROSATELLITE MỚI TỪ HỆ GEN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) BẰNG CÔNG CỤ TIN SINH HỌC Nguyễn Văn Sáng1, Nguyễn Minh Thành2, Võ Hồng Lộc1, Nguyễn Hoàng Thông1, Lê Hoàng Khôi Nguyên2* TÓM TẮT Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus, Sauvage 1878) là một trong những đối tượng xuất khẩu chủ lực của ngành thủy sản ở Việt Nam. Các nghiên cứu trước đây đã phát triển thành công một số bộ chỉ thị microsatellite trên cá Tra và các loài khác thuộc họ Pangasiidae bằng các phương pháp truyền thống. Tuy nhiên, ứng dụng của các microsatellite này chưa thỏa mãn được các yêu cầu trong công tác chọn giống cá Tra. Vì vậy, nghiên cứu hiện tại đã phát triển bộ multiplex PCR gồm 10 chỉ thị microsatellite mới dựa trên hệ gen cá Tra được công bố vào năm 2018. Kết quả phân tích trên 30 mẫu cá Tra cho thấy số lượng alen (NA) dao động từ 5 đến 11 mỗi locus. Hệ số đa dạng di truyền (PIC) trung bình, tỷ lệ dị hợp tử thực tế (HO) trung bình và tỷ lệ dị hợp tử lý thuyết (HE) trung bình trên tất cả các locus lần lượt là 0,729; 0,755 và 0,711. Mười chỉ thị microsatellite không cho thấy sự sai khác với cân bằng Hardy-Weinberg (HWE) sau khi hiệu chỉnh Bonferroni. Kết quả cho thấy bộ chỉ thị microstellite mới phát triển có độ đa hình cao và có tiềm năng phục vụ cho các mục đích trong chọn giống lâu dài trên cá Tra. Từ khóa: chỉ thị microsatellite, đa dạng di truyền, multiplex PCR, Pangasianodon hypophthalmus. I. MỞ ĐẦU nhiên, một trong những thách thức hiện nay của Nghề nuôi cá Tra (Pangasianodon chương trình chọn giống là xây dựng thông tin hypophthalmus, Sauvage 1878) rất phổ biến ở phả hệ nhằm ước tính chính xác các thông số di vùng Đồng bằng sông Cưu Long từ năm 1960 truyền và kiểm soát sự cận huyết nhằm nâng cao và trở thành đối tượng cho sự phát triển của nuôi hiệu quả chọn giống (Liu và ctv., 2018). trông thủy sản nhờ hệ thủy sinh đặc thù ở khu Microsatellite là những đoạn ADN ngắn vực này (Phan và ctv., 2009). Riêng ở Việt Nam, chứa một motif (từ 1 đến 6 bp) lặp lại nhiều lần cá Tra là một trong các loài xuất khẩu chủ lực với (Kelkar và ctv., 2010). Bởi vì microsatellite có tổng giá trị xuất khẩu năm 2019 đạt 2 tỷ USA. tính đa hình cao và phổ biến trên hệ gen của Năm 2001, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy hầu hết các loài sinh vật nhân thực, chỉ thị này sản II (RIA2) đã tiến hành chương trình chọn thường được ứng dụng trong các nghiên cứu về giống trên cá Tra nhằm nâng cao các tính trạng định danh loài, di truyền học quần thể, bản đồ tăng trưởng và kháng bệnh trên cá Tra, góp phần di truyền và truy xuất phả hệ (Mittal & Dubey, phát triển bền vững nghề nuôi cá Tra. Chương 2009; Miah và ctv., 2013). Trước đây, một số trình đã thành công nâng cao tốc độ tăng trưởng công trình đã phát triển chỉ thị microsatellite đạt 13% mỗi thế hệ (Nguyen và ctv., 2012). Tuy cho P. hypophthalmus (Volckaert và ctv., 1999; 1 Viện Nghiện cứu Nuôi trồng Thủy sản II 2 Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Quốc tế - ĐHQG Tp. HCM * Email: lhknguyen98@gmail.com 14 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
2. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Nguyễn Văn Sáng và ctv., 2013) và các loài II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP thuộc họ Pangasiidae (Hogan và May, 2002; NGHIÊN CỨU Na-Nakorn và ctv., 2006). Tại thời điểm đó, trình 2.1. Thu mẫu và ly trích ADN tự hệ gen cá Tra chưa được công bố nên tất cả các Mẫu cá Tra được sử dụng trong nghiên chỉ thị này đều được phát triển bằng phương pháp cứu có nguồn gốc từ tự nhiên theo 3 quần đàn: truyền thống gồm các bước xây dựng thư viện hệ quần đàn 1 (10 cá thể) thu thập từ biển Hồ, gen, xác định microsatellite bằng lai phân tử và Campuchia; quần đàn 2 (10 cá thể) từ các trại giải trình tự để xác định vùng thiết kế mồi (Zane giống ở Đồng bằng sông Cửu Long, thu thập từ và ctv., 2002). Phương pháp này mất rất nhiều cá bột hoặc cá trưởng thành từ tự nhiên; quần thời gian và chi phí với hiệu quả phát triển được đàn 3 (10 cá thể) từ thác Kratie, Campuchia. Tất microsatellite thấp (Abdelkrim và ctv., 2009). cả các mẫu cá này đều thuộc Chương trình chọn Các chỉ thị này cũng không được phát triển thành giống cá Tra thực hiện tại Trung tâm Quốc gia các bộ multiplex gây bất tiện cho việc xác định Giống Thủy sản Nước ngọt Nam Bộ, Cái Bè, alen và xử lý số liệu (Guichoux và ctv., 2011). Tiền Giang (trực thuộc Viên Nghiên cưu Nuôi Cho đến năm 2019, tổng cộng 5 chỉ thị phát triển trông Thuy san II). từ các nghiên cứu trước đã được tối ưu thành hai Các mẫu vây ngực được thu thập và ngâm bộ multiplex PCR để phục vụ cho truy xuất phả trong ethanol 80% và bảo quản ở nhiệt độ -20°C. hệ (Nguyen và ctv., 2019). Phương pháp kết tủa muối (Gaaib và ctv., 2011) Các chỉ thị microsatellite trước đây đã được sử dụng để ly trích ADN (có điều chỉnh được sử dụng trong nghiên cứu đánh giá đa để phù hợp với điều kiện tại RIA2). Mẫu mô cơ dạng di truyền của các quần thể cá Tra (Ha và vây sau khi cắt nhỏ được ủ trong 500 µl dung ctv., 2009; Na-Nakorn và ctv., 2009; Trần Thị dịch ly trích SDS 2% có chứa 10 µl Proteinase Phương Dung và ctv., 2020; Bùi Thị Liên Hà và K (Bioline) ở nhiệt độ 55°C trong 2 giờ. Sau ctv., 2016) và truy xuất phả hệ phục vụ cho chọn khi bổ sung 250 µl NaCl 5M, mẫu được ủ ở giống cá Tra (Bùi Thị Liên Hà và ctv., 2017; 4°C trong 15 phút và được ly tâm 13.000 vòng/ Nguyen và ctv., 2019). phút trong 15 phút. Chuyển tiếp 300 µl dịch Với trình tự hệ gen cá Tra được công bố vào nổi, bổ sung 1 ml ethanol 90% rồi giữ mẫu ở năm 2018 (Kim và ctv., 2018), các microsatellite 4°C trong 15 phút. Kết tủa được thu sau khi có thể được xác định nhanh chóng bằng công cụ ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút. Tiếp tục bổ tin sinh học. Các bộ mồi cũng được thiết kế để sung 500 µl ethanol 70%, ly tâm 10.000 vòng/ hoạt động trong điều kiện PCR đồng nhất nhằm phút trong 15 phút thu kết tủa ADN. Mẫu ADN phát triển các phản ứng multiplex PCR. Trong được làm khô và bảo quản trong 100 µl nước nghiên cứu này, để khắc phục các khuyết điểm cất không chứa nuclease. Chất lượng của ADN của phương pháp phát triển chỉ thị microsatellite được kiểm tra gel agrarose 1%, ADN không đứt truyền thống, các chỉ thị microsatellite mới gãy hay lẫn tạp đủ tiêu chuẩn để thực hiện các được phát triển theo phương pháp hiện đại dựa phản ứng PCR. Ngoài ra, nồng độ ADN cũng trên hệ gen cá Tra đã được công bố. Các thông được đo bằng máy quang phổ (Genova Nano số di truyền được tính toán để đánh giá sơ bộ Micro-volume Life Science™, Jenway, Anh) và mức độ đa hình của các chỉ thị, từ đó cho thấy điều chỉnh thành 100 ng/µl. tiềm năng ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng 2.2. Xác định chỉ thị microsatellite di truyền các quần đàn và truy xuất phả hệ, phục Trình tự hệ gen cá Tra (VN_pangasius) vụ cho mục đích chọn giống lâu dài trên cá Tra. được thu thập từ cơ sở dữ liệu NCBI (GenBank TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 15
3. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II assembly accession: GCA_003671635.1) ở 2.3. Kiểm định mồi và đánh giá bộ chỉ thị dạng 29 scaffold tương ứng với 29 nhiễm sắc microsatellite thể (NST) giả định (Bảng 1). Vì một NST giả Để sàn lọc nhanh, những cặp mồi chỉ được định có thể được xây dựng với nhiều scaffold kiểm định trên 3 cá thể, mỗi cá thể từ một quần (Kim và ctv., 2018), chúng tôi ưu tiên lựa đàn. Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể chọn các scaffold ở xa vùng tâm động và có tích là 10 µl bao gồm 1,0 µl ADN khuôn (100 chứa các gen đã được định danh liên quan ng/µl), 8,8 µl BIOTAQ Master Mix (Bioline), đến tăng trưởng của cá Tra. Trên mỗi scaffold, 0,1 µM mỗi mồi xuôi và mồi ngược. Điều kiện các chỉ thị microsatellite (các motif ADN từ của phản ứng PCR như sau: 94°C trong 5 phút, 2 đến 6 nucleotide) được xác định bằng công 35 chu kì bao gồm 94°C trong 30 giây, 55°C cụ Phobos (Mayer & Christoph, 2006-2010) trong 30 giây, 72°C trong 60 giây, và giai đoạn trên phần mềm Geneious Prime 2020.0.5. Các kéo dài cuối cùng ở 72°C trong 10 phút. Sản microsatellite có chứa motif trên 10 lần lặp lại phẩm PCR được nhuộm với GelRed (Biotium) được lựa chọn để phát triển mồi. Những cặp và điện di trên gel agarose 4% ở 200 V (6.7 V/ mồi khuếch đại các microsatellitte được thiết cm). Các bộ mồi cho sản phẩm PCR đặc hiệu kế bằng thông số mặc định trên phần mềm (sản phẩm nằm trong khoảng thiết kế từ 100 đến Geneious Prime 2020.0.5 với nhiệt độ bắt cặp 400 bp, có tối đa 2 vạch thể hiện cá thể dị hợp) tối ưu ở 55°C và độ dài mồi từ 18 đến 24 bp. và đa hình (ít nhất 1 trong 3 mẫu cá thể có dị Độ dài sản phẩm PCR mong muốn nằm trong hợp tử tại locus tương ứng) được lựa chọn cho khoảng từ 100 dến 400 bp. bước phát triển tiếp theo. Bảng 1. Các scaffold (Sc) trên NST giả định tương ứng được lựa chọn để thiết kế mồi*. NST Scaffold NST Scaffold NST Scaffold Số 1 Sc62 Số 11 Sc46 Số 21 Sc26 Số 2 Sc68 Số 12 Sc66 Số 22 Sc20 Số 3 Sc31 Số 13 Sc61 Số 23 Sc29 Số 4 Sc15 Số 14 Sc56 Số 24 Sc18 Số 5 Sc47 Số 15 Sc09 Số 25 Sc42 Số 6 Sc55 Số 16 Sc40 Số 26 Sc21 Số 7 Sc58 Số 17 Sc39 Số 27 Sc63 Số 8 Sc07 Số 18 Sc30 Số 28 Sc10 Số 9 Sc24 Số 19 Sc70 Số 29 Sc45 Số 10 Sc71 Số 20 Sc34 * Dữ liệu được thu thập trên NCBI, công bố bởi Kim và ctv., (2018) 16 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
4. TẠP CHÍNGHỀ CÁSÔNGCỬULONG -SỐ18THÁNG12/2020 Bảng 2. Thông tin 10 chỉ thị microsatellite được phát triển từ trình tự hệ gen cá Tra P. hypophthalmus Loại huỳnh Nồng độ mồi tối ưu Chỉ thị NST Motif* Trình tự mồi (5’-3’) quang (µM) Pahy-01 Số 1 (TCA)11 F: GCACGTTTCACCTCCATCCA 6FAM 0,2 R: GTTGCAGGAAAACACCACGG Pahy-02 Số 4 (TG)24 F: AGCGTTTCTTATCCCGCCTC PET 0,4 VIỆN NGHIÊNCỨUNUÔITRỒNGTHỦYSẢNII R: CAGACAGTTTCCCTGGTGGT Pahy-03 Số 5 (TG)23 F: AGGTGAAAATCCCCGAGCAG VIC 0,2 R: TCCCGATGCCAGAGAACCTA Pahy-04 Số 6 (GT)15 F: TCAGTGCACGTCTTACCCAC 6FAM 0,2 R: CGTTGTGTGCCCTCAAAGTG Pahy-06 Số 8 (AC)20 F: TGAAGCGTGGAGAGAAGCTG NED 0,2 R: GTAACCGTTTCTGGGGCTCA Pahy-10 Số 16 (TC)20 F: TCTTGAACACGTGGAGGAGC NED 0,2 R: TATGGCTATGGCTGCTGAGC Pahy-13 Số 19 (AC)17 F: CACGCTGAGTGTGAAATGCC 6FAM 0,2 R: TGCTTTCCCATGATGCACCT Pahy-15 Số 21 (AC)20 F: ACCCTCTGTGGTGTCCTTCA VIC 0,4 R: GGGACTCTGTGGAGCGTAAC Pahy-17 Số 23 (AC)17 F: GCGCTGATGTGCTTTTATACTGA PET 0,2 R: GATGCTGCCAGACACTGAGT Pahy-18 Số 25 (GT)20 F: CTTCGACTTCCAAGGCACCT VIC 0,2 R: TGTGAGCTCATCCTCCCTCA F: mồi xuôi, R: mồi ngược. 17 *Cách ky hiệu: (Loại motif) Số lần lặp lại.
5. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Những mồi xuôi của các microsatellite cho base (Butler và ctv., 2004). Xác định các alen kết quả đặc hiệu và đa hình trên gel agarose được thực hiện trên phần mềm GeneMapper 5 được đánh dấu huỳnh quang ở đuôi 5’ (Life (Applied Biosystems). Các mồi sau khi được Technologies). Mồi xuôi từ các cặp mồi được tối ưu bằng các phản ứng singleplex PCR, được lựa chọn phải cho sản phẩm PCR có kích thước nhóm lại thành một bộ multiplex PCR. Các phù hợp: khoảng cách giữa hai sản phẩm PCR thông số di truyền như số lượng alen (NA), hệ có cùng màu huỳnh quang cách nhau 50 bp để số đa dạng di truyền (PIC), tỷ lệ dị hợp tử thực không bị trùng lặp khi phân tích đoạn ADN tế (HO), tỷ lệ dị hợp tử lý thuyết (HE) và mức trong phản ứng multiplex. Phản ứng singleplex độ sai khác so với cân bằng Hardy-Weinberg PCR của những cặp mồi khuếch đại các chỉ thị (HWE) được tính toán bằng phần mềm Cervus này được tối ưu trên 3 cá thể. Mỗi 10 µl phản 3.0.7 (Marshall và ctv., 1998) để đánh giá bộ ứng bao gồm 1,0 µl ADN khuôn (5 ng/ µl), chỉ thị multiplex PCR mới phát triển trên 30 cá 5 µl Multiplex PCR Master Mix (QIAGEN thể cá Tra (10 cá thể/quần đàn). Multiplex PCR Kit™), 0,2 μM hỗn hợp mồi III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN (gồm 0,1 μM mồi xuôi và 0,1 μM mồi ngược) Từ 29 scaffold với tổng kích thước là 226,9 và 3,8 µl nước cất không chứa nuclease. Điều Mb thu nhận từ NCBI, nghiên cứu này đã xác kiện của phản ứng PCR như sau: 95°C trong định được 47,499 chỉ thị microsatellite và lựa 15 phút, 30 chu ky bao gồm 95°C trong 30 chọn ngẫu nhiên 145 chỉ thị (5 chỉ thị/scaffold) giây, 55°C trong 90 giây, 72°C trong 60 giây, để phát triển mồi. Kết quả kiểm định mồi trên 3 và giai đoạn kéo dài cuối cùng ở 60°C trong cá thể cho thấy 63 chỉ thị (43,5%) có sản phẩm 30 phút. Sản phẩm PCR được phân tích đoạn đặc hiệu và đa hình. Các cặp mồi có kích thước ADN trên hệ thống điện di mao quản 3500 sản phẩm PCR phù hợp và phân bố trên các Genetic Analyzer (Applied Biosystems) tại scaffold khác nhau (tương ứng với các nhiễm Công ty TNHH Dịch Vụ Và Thương Mại Nam sắc thể khác nhau) được lựa chọn để phát triển Khoa (Quận 7, Thành phố Hồ Chí Minh). Thiết thành một bộ multiplex PCR gồm mười chỉ thị bị này có thể xác định alen trên nhiều locus (Bảng 2, xem trang 17). microsatellite với độ chính xác lên đến từng Bảng 3. Kết quả phân tích microsatellite từ phản ứng multiplex PCR gồm 10 chỉ thị. Vùng kích thước Chỉ thị N H H PIC P A alen (bp) O E HWE Pahy-01 6 104 - 119 0,733 0,775 0,725 0,799 Pahy-02 11 286 - 317 0,533 0,766 0,734 0,216 Pahy-03 10 204 - 232 0,867 0,821 0,784 0,095 Pahy-04 9 271 - 291 0,867 0,872 0,841 0,413 Pahy-06 8 304 - 324 0,800 0,731 0,672 0,328 Pahy-10 5 216 - 226 0,600 0,538 0,488 0,343 Pahy-13 8 194 - 206 0,800 0,773 0,731 0,882 Pahy-15 11 308 - 338 0,677 0,741 0,689 0,632 Pahy-17 8 205 - 223 0,677 0,753 0,710 0,399 Pahy-18 11 114 - 136 0,733 0,775 0,731 0,212 Trung bình 8,7 0,729 0,755 0,711 bp: base pairs, NA: số lượng alen, HO: tỷ lệ dị hợp tử thực tế, HE: tỷ lệ dị hợp tử lý thuyết, PIC: hệ số đa dạng di truyền, PHWE: giá trị P trong đánh giá cân bằng Hardy-Weinberg. 18 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
6. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II Bảng 3 trình bày kết quả phân tích hơn khả năng ứng dụng, bộ chỉ thị mới phát microsatellite trên 30 cá thể cá Tra. Tổng cộng triển cần được thử nghiệm trên số lượng mẫu 87 alen đã được phát hiện trên 10 locus với số lớn hơn và trên các quần đàn khác nhau. lượng alen dao động từ 5 đến 11 alen mỗi locus, IV. KẾT LUẬN trung bình 8,7 ± 2,1 alen mỗi locus. Tỷ lệ dị hợp Bằng phương pháp phát triển microsatellite tử (HO và HE) và hệ số PIC lần lượt dao động hiện đại với việc kết hợp công cụ tin sinh học và từ 0,533 đến 0,867 (trung bình 0,729 ± 0,110); công nghệ điện di mao quản có đánh dấu huỳnh 0,538 đến 0,872 (trung bình 0,755 ± 0,086) và quang, nghiên cứu này đã phát triển thành công 0,488 đến 0,841 (trung bình 0,711 ± 0,092). một bộ multiplex gồm 10 chỉ thị microsatellite Trong số 10 chỉ thị microsatellite mới được phát mới dựa trên các scaffold hệ gen cá Tra P. triển, 9 chỉ thị có mức độ đa hình cao (PIC > hypophthalmus có độ đa hình cao (hệ số PIC 0,5) và 1 chỉ thị (Pahy-10) có mức độ đa hình trung bình đạt 0,711) và không có sự sai khác trung bình (0,25 0,05). hệ phục vụ cho chương trình chọn giống cá Tra. Với kết quả đánh giá sơ bộ mức độ đa hình Tuy nhiên, đây chỉ là kết quả ban đầu về đánh trên 30 mẫu cá Tra, bộ chỉ thị microsatellite giá mức độ đa hình của bộ chỉ thị. Do đó, để có mới phát triển cho thấy tiềm năng ứng dụng thể so sánh với kết quả từ các nghiên cứu trước, lớn trong nghiên cứu về đa dạng di truyền quần bộ chỉ thị này cần được đánh giá trong các ứng thể và truy xuất phả hệ nhằm phục vụ cho chọn dụng khác ở quy mô mẫu lớn hơn và trên các giống ở cá Tra. So với phương pháp phát triển quần đàn khác nhau. từ các nghiên cứu trước, nghiên cứu này có tính LỜI CẢM ƠN mới nhờ phát triển các chỉ thị microsatellite Nghiên cứu này được tài trợ kinh phí bởi dựa vào hệ gen cá Tra được công bố bằng các chương trình VLIR-UOS South Initiatives công cụ tin sinh học và công nghệ điện di mao (mã số SI-2019-01-26). Chúng tôi xin gửi lời quản có đánh dấu huỳnh quang kết hợp hệ thống cảm ơn đến Laboratory of Biodiversity and phân tích đoạn ADN. Từ đó, ngoài việc giảm Evolutionary Genomics (LBEG), Department thời gian phát triển chỉ thị, nghiên cứu còn đồng of Biology, Faculty of Sciences, KU Leuven, Bỉ nhất điều kiện phản ứng PCR trong bước sàn với những hỗ trợ về công nghệ và ky thuật. lọc mồi, thuận lợi cho việc nhóm các cặp mồi TÀI LIỆU THAM KHẢO thành bộ multiplex PCR, xác định chính xác Tài liệu tiếng Việt kích thước alen thông qua phân tích đoạn ADN, Trần Thị Phương Dung, Bùi Thị Liên Hà, Nguyễn Hoàng Thông, Nguyễn Ngọc Thùy Trang, Trần đồng thời còn xác định tương đối vị trí của chỉ Hoàng Gia Linh, Nguyễn Văn Sáng, 2020. Hiệu thị microsatellite trên hệ gen cá Tra, mở ra triển chỉnh các thành phần cho phản ứng PCR của các vọng cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc microsatellite và nghiên cứu đa dạng di truyền các tìm chỉ thị liên kết các tính trạng mong muốn dễ quần thể cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus). Tạp chí Khoa học, 17(9), 1575-1587, Trường Đại dàng hơn. Các ưu điểm kể trên là vượt trội hơn học Sư Phạm Tp. Hồ Chí Minh. so với các chỉ thị miocrosatellite được phát triển Bùi Thị Liên Hà, Trì Thanh Thảo, Nguyễn Huỳnh theo phương pháp truyền thống trong các nghiên Duy, Nguyễn Thanh Vũ, Trịnh Quốc Trọng, cứu trước đây. Tuy vậy, để đánh giá chính xác 2016. Nghiên cứu đa dạng di truyền phục vụ chọn TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 19
7. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II giống cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus). family Pangasiidae. Molecular Ecology Notes, Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, 2(1), 38-41. 21, 94-101. Kelkar, Y.D., Strubczewski, N., Hile, S.E., Bùi Thị Liên Hà, Lê Ngọc Thùy Trang, Nguyễn Văn Chiaromonte, F., Eckert, K.A., Makova, K.D., Sáng, 2017. Thử nghiệm xác định phả hệ bằng 2010. What is a microsatellite: a computational chỉ thị phân tử microsatellite trên quần đàn chọn and experimental definition based upon repeat giống cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus). mutational behavior at A/T and GT/AC repeats. Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, Genome Biol Evol, 2, 620-635. 5, 88-97. Kim, O.T.P., Nguyen, P.T., Shoguchi, E., Hisata, K., Nguyễn Văn Sáng, Trịnh Quốc Trọng, Nguyễn Vo, T.T.B., Inoue, J., Shinzato, C., Le, B.T.N., Thanh Vũ, Bùi Thị Liên Hà, Nguyễn Thế Nishitsuji, K., Kanda, M., Nguyen, V.H., Nong, Vương, Nguyễn Thị Đang, Nguyễn Huỳnh Duy, H.V., Satoh, N., 2018. A draft genome of the Ngô Hồng Ân, Trần Hữu Phúc, 2013. Đánh giá striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus, hiệu quả chọn giống cá Tra (Pangasianodon for comparative analysis of genes relevant to hypophthalmus) về tăng trưởng và tỷ lệ phi lê. development and a resource for aquaculture Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II. Báo improvement. BMC Genomics; 19(1), 733. cáo tổng kết đề tài. Liu, Q., Cui, F., Hu, P., Yi, G., Ge, Y., Liu, W., Yan, VASEP. Xuất khẩu cá Tra năm 2019 đạt 2 tỷ USD, H., Wang, L., Liu, H., Song, J., Jiang, Y., Zhang, 2020. Truy cập tại: L., Tu, Z., 2018. Using of microsatellite DNA Tuc/1207_58983/Xuat-khau-ca-tra-nam-2019- profiling to identify hatchery-reared seed and dat-2-ty-USD.htm [Ngày truy cập: 06/12/2020]. assess potential genetic risks associated with Tài liệu tiếng Anh large-scale release of swimming crab Portunus Abdelkrim, J., Robertson, B., Stanton J.A., Gemmell, trituberculatus in Panjin, China. Fisheries N., 2009. Fast, cost-effective development of Research, 207, 187-196. species-specific microsatellite markers by genomic Marshall, T.C., Slate, J., Kruuk, L.E.B., Pemberton, sequencing. Biotechniques, 46(3), 185-192. J.M., 1998. Statistical confidence for likelihood- Botstein, D., White, R.L., Skolnick, M., Davis, R.W., based paternity inference in natural populations. 1980. Construction of a genetic linkage map in man 7(5), 639-655. using restriction fragment length polymorphisms. Mayer, C., 2006-2010. Phobos 3.3.11. Am J Hum Genet, 32(3), 314-331. rub.de/ecoevo/cm/cm_phobos.htm. Butler, J.M., Buel, E., Crivellente, F., McCord, Miah, G., Rafii, M.Y., Ismail, M.R., Puteh, A.B., B.R., 2004. Forensic DNA typing by capillary Rahim, H.A., Islam, N., Latif, M.A., 2013. electrophoresis using the ABI Prism 310 and A review of microsatellite markers and their 3100 genetic analyzers for STR analysis. applications in rice breeding programs to Electrophoresis, 25(10-11), 1397-1412. improve blast disease resistance. Int J Mol Sci, Gaaib, J., And, A., Al-Assie, A., 2011. Simple salting 14(11), 22499-22528. – out method for genomic DNA extraction from Mittal, N., Dubey, A., 2009. Microsatellite markers whole blood. - A new practice of DNA based markers in Guichoux, E., Lagache, L., Wagner, S., Chaumeil, P., molecular genetics. Pharmacognosy Reviews, 3, Leger, P., Lepais O., Lepoittevin, C., Malausa, T., 235-246. Revardel, E., Salin, F., Petit R.J., 2011. Current Na-Nakorn, U., Moeikum, T., 2009. Genetic trends in microsatellite genotyping. Mol Ecol diversity of domesticated stocks of striped Resour, 11(4), 591-611 catfish,Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage Ha, H.P., Nguyen, T.T.T., Poompuang, S., Na- 1878), in Thailand: Relevance to broodstock Nakorn, U., 2009. Microsatellites revealed no management regimes. Aquaculture; 297(1-4): genetic differentiation between hatchery and 70-77. doi:10.1016/j.aquaculture.2009.09.014 contemporary wild populations of striped catfish, Na-Nakorn, U., Sriphairoj, K., Sukmanomon, S., Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage 1878) Poompuang, S., Kamonrat, W., 2006. Polymorphic in Vietnam. Aquaculture, 291(3-4), 154-160. microsatellite primers developed from DNA of the Hogan, Z.S., May, B.P., 2002. Twenty-seven new endangered Mekong giant catfish,Pangasianodon microsatellites for the migratory Asian catfish gigas (Chevey) and cross-species amplification in 20 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020
8. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II three species of Pangasius. Molecular Ecology De Silva, S. S., 2009. Current status of farming Notes, 6(4), 1174-1176. practices of striped catfish, Pangasianodon Nguyen, M.T., Le, N.T.P., Nguyen, T.L., Duong, hypophthalmus in the Mekong Delta, Vietnam. A.L., 2019. Parentage Assignment in Striped Aquaculture, 296(3-4), 227-236. Catfish (Pangasianodon hypophthalmus) Based Volckaert, F., Hellemans, B., Pouyaud, L, 1999. on Microsatellite Markers. The Israel Journal of Nine polymorphic microsatellite markers in the Aquaculture - Bamidgeh; 71. SE Asian catfishes Pangasius hypophthalmus Nguyen, V.S., Klemetsdal, G., Ødegård, J., Gjøen, and Clarias batrachus. Animal Genetics - ANIM H., 2012. Genetic parameters of economically GENET, 30, 383-384. important traits recorded at a given age in Zane, L., Bargelloni, L., Patarnello, T., 2002. striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus). Strategies for microsatellite isolation: a review. Aquaculture, 344–349, 82–89. Mol Ecol, 11(1), 1-16. Phan, L.T., Bui, T. M., Nguyen, T. T. T., Gooley, G. J., Ingram, B. A., Nguyen, H. V., Nguyen, P. T., TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020 21
9. VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN II PRIMARY DEVELOPMENT AND CHARACTERIZATION OF NOVEL MICROSATELLITES FROM GENOME OF THE STRIPED CATFISH (Pangasianodon hypophthalmus) USING DATA MINING APPROACH Nguyen Van Sang1, Nguyen Minh Thanh2, Vo Hong Loc1, Nguyen Hoang Thong1, Le Hoang Khoi Nguyen2* ABSTRACT The striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) (Sauvage, 1878), locally known as tra catfish, is one of the iconic species for aquaculture development in Vietnam. A number of microsatellites were previously developed using traditional methods. However, these microsatellites did not meet the requirements of the selective breeding program for the striped catfish. The current study succesfully developed a multiplex PCR of 10 novel microsatellites based on the striped catfish genomic sequences which were published in 2018. Microsatellite analysis for 30 striped catfish individuals demonstrated that the number of alleles (NA) ranged from 5 to 11 alleles per locus. The average polymorphic information content (PIC), the average observed heterozygosity (HO) and the average expected heterozygosity (HE) were 0.729; 0.755 and 0.711, respectively. None of the loci was observed deviated from Hardy–Weinberg equilibrium after Bonferroni correction. This new set of microsatellites was highly polymorphic and will be useful in the selective breeding programs for the striped catfish. Keywords: genetic diversity, microsatellites, multiplex PCR, Pangasianodon hypophthalmus. Người phản biện: TS. Nguyễn Viêt Dung Người phản biện: TS. Ngô Huynh Phương Thao Ngày nhận bài: 22/11/2020 Ngày nhận bài: 22/11/2020 Ngày thông qua phản biện: 12/12/2020 Ngày thông qua phản biện: 16/12/2020 Ngày duyệt đăng: 25/12/2020 Ngày duyệt đăng: 25/12/2020 1 Research Institure for Aquaculture No.2 2 School of Biotechnology, International University, Ho Chi Minh city * Email: lhknguyen98@gmail.com 22 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 18 - THÁNG 12/2020