Optimizing conditions for treatment and extraction of collagen from fanbellied leatherjacket skin Monacanthus chinensis (Osbeck, 1765)

pdf 14 trang Gia Huy 20/05/2022 1020
Bạn đang xem tài liệu "Optimizing conditions for treatment and extraction of collagen from fanbellied leatherjacket skin Monacanthus chinensis (Osbeck, 1765)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfoptimizing_conditions_for_treatment_and_extraction_of_collag.pdf

Nội dung text: Optimizing conditions for treatment and extraction of collagen from fanbellied leatherjacket skin Monacanthus chinensis (Osbeck, 1765)

  1. Vietnam Journal of Marine Science and Technology; Vol. 20, No. 4A; 2020: 141–154 DOI: Optimizing conditions for treatment and extraction of collagen from fan- bellied leatherjacket skin Monacanthus chinensis (Osbeck, 1765) Doan Thi Thiet1,*, Pham Xuan Ky1, Phan Bao Vy1, Nguyen Phuong Anh1, Le Ho Khanh Hy1, Dao Viet Ha1, Vu Ngoc Boi2 1Institute of Oceanography, VAST, Vietnam 2Nha Trang University, Khanh Hoa, Vietnam *E-mail: doanthithiet671990@gmail.com Received: 28 August 2020; Accepted: 26 October 2020 ©2020 Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) Abstract The fan-bellied leatherjacket skin was treated to extract collagen by chemical method. The non-collagenous substances and the pigment in the skin were removed with NaOH and H2O2, respectively. Collagen was extracted with acetic acid. The treatment and extraction conditions were optimized by response surface methodology. The concentrations, skin/solution ratios (g/ml) and times were surveyed. The optimum conditions to remove the non-collagenous substances were as follows: the concentration of NaOH at 0.15M, the ratio (g/ml) at 1/13.9, time at 56.9 hours. Using H2O2 with the concentration at 6%, the skin/solution ratio (g/ml) at 1/2, time at 10 minutes were suitable values for skin pigmentation removal. For collagen extraction, the concentration of acetic acid at 0.53M, skin/solution ratio at 1/9.6 g/ml and time in 59.6 hours were optimal. Keywords: Chemical method, fan-bellied leatherjacket skin, non-collagenous substances, pigment. Citation: Doan Thi Thiet, Pham Xuan Ky, Phan Bao Vy, Nguyen Phuong Anh, Le Ho Khanh Hy, Dao Viet Ha, Vu Ngoc Boi, 2020. Optimizing conditions for treatment and extraction of collagen from fan-bellied leatherjacket skin Monacanthus chinensis (Osbeck, 1765). Vietnam Journal of Marine Science and Technology, 20(4A), 141–154. 141
  2. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Biển, Tập 20, Số 4A; 2020: 141–154 DOI: Nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện xử lý và tách chiết collagen từ da cá bò gai móc Monacanthus chinensis (Osbeck, 1765) Đoàn Thị Thiết1,*, Phạm Xuân Kỳ1, Phan Bảo Vy1, Nguyễn Phƣơng Anh1, Lê Hồ Khánh Hỷ1, Đào Việt Hà1, Vũ Ngọc Bội2 1Viện Hải dương học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Việt Nam 2Trường Đại học Nha Trang, Khánh Hòa, Việt Nam *E-mail: doanthithiet671990@gmail.com Nhận bài: 28-8-2020; Chấp nhận đăng: 26-10-2020 Tóm tắt Da cá bò gai móc Monacanthus chinensis được xử lý để tách chiết collagen bằng phương pháp hóa học. Tạp chất phi collagen được xử lý bằng NaOH, sắc tố của da cá được loại bỏ bằng H2O2 và chiết tách collagen bằng acid acetic. Điều kiện xử lý và tách chiết collagen được tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng. Nồng độ, tỷ lệ da/dung dịch (g/ml) và thời gian ngâm được kiểm chứng thực nghiệm. Giá trị tối ưu để khử tạp chất phi collagen được xác định: Nồng độ NaOH là 0,15M, tỷ lệ: 1/13,9 g/ml, thời gian ngâm khử: 56,9 giờ. Sử dụng H2O2 ở nồng độ 6%, tỷ lệ (g/ml) 1/2, thời gian ngâm 10 phút là thích hợp để tẩy màu da cá. Đối với việc chiết collagen, nồng độ acid acetic 0,53M, tỷ lệ (g/ml) 1/9,6, thời gian ngâm chiết 59,6 giờ là tối ưu. Từ khóa: Collagen, da cá bò gai móc, hợp chất phi collagen, sắc tố, phương pháp hóa học. ĐẶT VẤN ĐỀ Trên thế giới, nghiên cứu và tách chiết Collagen là một dạng protein đặc biệt collagen được thực hiện từ cá nóc hổ (Takifugu chiếm khoảng 25–35% tổng lượng protein rubripes) [7], da cá tuyết (Gadus morhua) [8], trong cơ thể. Có khoảng 27 loại collagen, được cơ cá khế (Seriola quinqueradiata) [9], da cá đặt tên I–XXVII được phát hiện [1]. Collagen nóc bạc Lagocephalus gloveri [10], xương sống được ứng dụng rộng rãi trong y dược, mỹ và hộp sọ cá ngừ (Katsuwonus Pelamis) [11], phẩm, thực phẩm [2]. vảy và da cá chẽm (Lates calcarifer) [12], da, Hiện nay, collagen từ da, xương gia súc xương và cơ cá bò (Odonus niger) [13], cá ngừ mắt to Thunnus obesus [14]. Trong khi đó, ở như lợn, bò được ử dụng rộng rãi trong lĩnh vực Việt Nam, nghiên cứu tách chiết và thành phần thực phẩm và nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng collagen từ các sinh vật biển chỉ mới được tiến nguồn collagen từ sinh vật biển, đặc biệt là từ hành ở cá mối Saurida sp. và cá sòng Nhật da cá biển, có hoạt tính sinh học và có tiềm Trachurus japonicus [15]. năng ứng dụng lớn [3–5]. Collagen từ da cá Xử lý và tách chiết collagen thường được biển ngày càng được quan tâm nhờ tính an toàn thực hiện bằng phương pháp hóa học với các cao, dễ hấp thu (do có trọng lượng phân tử hóa chất khác nhau. Phan Dinh Tuan et al., thấp), chứa các peptid có khả năng chống oxy [16] đã chiết collagen từ da cá tra hóa, khử gốc tự do và không mang mầm bệnh (Pangasianodon hypophathalmus) bằng acid như từ động vật trên cạn [6]. acetic và loại muối trong sản phẩm bằng thẩm 142
  3. Optimizing conditions for treatment and extraction tích. Nhiều công trình khác sử dụng NaOH và cá bò gai móc ở Việt Nam bằng phương pháp Butanol để xử lý và tẩy màu cho da cá và tách hóa học. chiết collagen bằng acid acetid [17–20], một số tác giả sử dụng H2O2 để tẩy màu [21–23]. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN Những nghiên cứu này đều cho hiệu suất tách CỨU chiết khá cao. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu Vật liệu nào xác định được các giá trị tối ưu của Cá bò gai móc (Monacanthus chinensis) phương pháp hóa học trong tách chiết collagen được thu ở vùng biển Ninh Hòa - Khánh Hòa, ở cá biển. được rửa sạch bên ngoài, ướp đá xay (nhiệt độ Cá bò gai móc là loài cá phổ biến ở vùng < 4oC) và vận chuyển ngay về phòng thí biển Nam Trung Bộ [24]. Phần cơ của cá nghiệm tại Viện Hải dương học trong vòng 6 được dùng làm thực phẩm tươi hoặc chế biến giờ. Sau đó, da cá được thu và rửa bằng nước ở dạng khô, phần da cá Bò gai móc thường lạnh (nhiệt độ ≤ 10oC), cắt thành những miếng chiếm một tỷ lệ khoảng 10% nhưng chưa nhỏ có kích thước 1 × 1 cm, để ráo và lưu trữ ở o được sử dụng trong việc tách chiết và thu -30 C để dùng làm nguyên liệu nghiên cứu. nhận collagen. Dựa trên các quá trình nghiên Phƣơng pháp nghiên cứu cứu collagen từ phụ phẩm của các loài cá Bố trí thí nghiệm biển, bài báo này trình bày kết quả tối ưu hóa Sơ đồ thí nghiệm quá trình xử lý và tách các yếu tố xử lý và tách chiết collagen từ da chiết collagen. Da cá bò gai móc Xử lý cơ học Thực nghiệm tối ưu hóa: Khử tạp chất Nồng độ NaOH? phi collagen Tỷ lệ? Thời gian xử lý? Rửa Thực nghiệm tối ưu hóa Nồng độ H2O2 ? Tẩy mầu Tỷ lệ? Thời gian ngâm? Rửa Thực nghiệm tối ưu hóa Chiết collagen Nồng độ CH3COOH? Tỷ lệ da cá/ dung dịch ? Thời gian xử lý? Lọc Kết tủa Nồng độ NaCl? Thời gian tủa? Ly tâm Thẩm tích Đông khô Collagen thành phẩm Hình 1. Sơ đồ thí nghiệm quá trình xử lý và tách chiết collagen 143
  4. Doan Thi Thiet et al. Tối ưu hóa điều kiện khử tạp chất phi án cấu trúc có tâm cấp hai - 3 yếu tố, cách tay collagen đòn α có giá trị 1,68. Hóa chất được sử dụng là NaOH (Wako, Phương trình hồi quy đầy đủ biểu diễn sự Nhật Bản). Nồng độ NaOH, thời gian xử lý, và ảnh hưởng của các biến mã hoá tới hàm mục tỷ lệ da cá/dung dịch là yếu tố ảnh hưởng đến tiêu là đa thức bậc hai [25] có dạng: hiệu suất khử protein phi collagen (PPC) (%) 2 2 Y = b0+ b1X1 + b2X2 + b3X3 + b11X1 + b22X2 + và hiệu suất khử lipit (%). 2 Nồng độ NaOH được bố trí để tối ưu hóa từ b33X3 + b1b2X1X2 + b1b3X1X3 + b2b3X2X3 (1) 0,07–0,2M; thời gian 24–72 h; tỷ lệ dung dịch Trong đó: Y là hàm mục tiêu; X1, X2, X3 là các NaOH/da cá 1/5 - 1/15 g/ml được khảo sát để biến mã hoá, b0 là hệ số tự do; b1, b2, b3 là hệ số chọn ra thông số tối ưu nhất. Nhiệt độ để xử lý bậc 1; b11, b22, b33 là hệ số bậc 2; b12, b13, b23 là da cá từ 4–6oC. hệ số tương tác của cặp yếu tố X1, X2, X3. Số thí nghiệm theo phương án cấu trúc có tâm cấp hai - ba yếu tố là gồm 17 thí nghiệm Thực nghiệm trong đó bao gồm 8 thí nghiệm nhân tố, 6 thí Sau khi mã hóa các biến và tiến hành thí nghiệm sao và 3 thí nghiệm ở tâm. Với phương nghiệm, kết quả thực nghiệm như bảng sau. Bảng 1. Ma trận thực nghiệm trực giao cấp hai của công đoạn khử tạp chất bằng NaOH (M: Khối lượng mol) Biến mã hóa biến thực Biến độc lập Hàm mục tiêu Thí Nồng độ Thời Tỷ lệ da Nồng độ Thời Tỷ lệ da Hiệu suất Hiệu suất nghiệm NaOH gian xử cá/dung NaOH gian cá/dung môi khử PPC khử lipit X1 lý X2 môi X3 (M) (giờ) (g/ml) Y1(%) Y2(%) 1 1 1 1 0,2 72 1/15 76,5 75,2 2 1 1 -1 0,2 72 1/5 60,1 56,1 3 1 -1 1 0,2 24 1/15 61,2 50,2 4 1 -1 -1 0,2 24 1/5 55,2 46,9 5 -1 1 1 0,07 72 1/15 44,4 48,9 6 -1 1 -1 0,07 72 1/5 38,4 42,7 7 -1 -1 1 0,07 24 1/15 40,2 42,9 8 -1 -1 -1 0,07 24 1/5 35,8 40,1 9 -1,68 0 0 0,03 48 1/10 31,1 36,4 10 1,68 0 0 0,24 48 1/10 84,3 75,2 11 0 -1,68 0 0,14 7,6 1/10 46,1 48,3 12 0 1,68 0 0,14 88,4 1/10 78,2 70,2 13 0 0 -1,68 0,14 48 1/1,6 36,7 35,2 14 0 0 1,68 0,14 48 1/18 78,2 74,5 15 0 0 0 0,14 48 1/10 80,4 80,4 16 0 0 0 0,14 48 1/10 83,1 81,2 17 0 0 0 0,14 48 1/10 81,9 78,9 Loại sắc tố bằng H2O2 Tối ưu hoá thông số chiết collagen Sau khi xử lý NaOH, da cá được rửa lại Hóa chất sử dụng acid acetic (Merk, Đức). bằng nước lạnh để đưa về pH trung tính rồi Trong công đoạn này, các thông số nồng độ đem xử lý H2O2 (nồng độ 2, 4, 6, 8% trong acid (M), thời gian chiết (giờ) và tỷ lệ da nước cất; tỷ lệ (g/ml) là 1/1, 1/2, 1/3, 1/4; thời cá/dung dịch (g/ml) là yếu tố ảnh hưởng. Các gian ngâm 5, 10, 15, 20 phút) để tẩy màu cho hàm mục tiêu bao gồm: Hiệu suất thu hồi nguyên liệu nhằm mục đích sản phẩm collagen collagen (%) và độ nhớt collagen (cP). thu được có màu sáng hơn. Tiến hành xác định Nồng độ acid từ 0,3–0,7M; thời gian 24–72 độ nhớt của dung dịch sau xử lý và độ trắng h; tỷ lệ da cá/dung dịch (1/5 - 1/12 g/ml) được của da cá sau xử lý để chọn ra nồng độ, thời khảo sát để chọn ra thông số tối ưu nhất. Nhiệt o gian và tỷ lệ ngâm H2O2 thích hợp nhất. độ chiết da cá từ 4–6 C. Collagen trong dịch 144
  5. Optimizing conditions for treatment and extraction chiết được kết tủa bằng NaCl ở nồng độ 3M, hồi quy đầy đủ biểu diễn sự ảnh hưởng của các thời gian 20 phút, ly tâm ở 4oC thu kết tủa và biến mã hoá tới hàm mục tiêu là đa thức bậc xác định khối lượng. hai có dạng tương tự như phương trình (1). Tương tự như thiết kế thí nghiệm ở phần xử Thực nghiệm lý da cá, số thí nghiệm cho công đoạn chiết Sau khi mã hóa các biến và tiến hành thí collagen bao gồm 17 thí nghiệm. Phương trình nghiệm, kết quả thực nghiệm như bảng sau. Bảng 2. Ma trận thực nghiệm trực giao cấp hai của công đoạn chiết collagen (M: Khối lượng mol) Biến mã hóa - Biến thực Biến độc lập Hàm mục tiêu Thí Nồng độ Thời Tỷ lệ ngâm Nồng độ Thời Tỷ lệ ngâm da Hiệu suất Độ nhớt nghiệm CH COOH gian da cá/dung CH COOH gian cá/dung môi 3 3 (%) (cP) X1 X2 môi X3 (M) (giờ) (g/ml) 1 1 1 1 0,7 72 1/12 14,2 4,02 2 1 1 -1 0,7 72 1/5 9,09 4,63 3 1 -1 1 0,7 24 1/12 10,3 5,03 4 1 -1 -1 0,7 24 1/5 9,09 5,16 5 -1 1 1 0,3 72 1/12 7,3 5,48 6 -1 1 -1 0,3 72 1/5 6,1 5,43 7 -1 -1 1 0,3 24 1/12 7.2 6,38 8 -1 -1 -1 0,3 24 1/5 5,6 6,43 9 -1,68 0 0 0,16 48 1/8,5 4,15 7,05 10 1,68 0 0 0,84 48 1/8,5 15,1 3.72 11 0 -1,68 0 0,5 7,6 1/8,5 7,71 6,95 12 0 1,68 0 0,5 88 1/8,5 13,7 5,63 13 0 0 -1,68 0,5 48 1/2,6 7,8 6,32 14 0 0 1,68 0,5 48 1/14 10,8 6.88 15 0 0 0 0,5 48 1/8,5 15,2 7,46 16 0 0 0 0,5 48 1/8,5 16 7,52 17 0 0 0 0,5 48 1/8,5 14,9 7,16 Phƣơng pháp phân tích tích ANOVA cho mô hình đáp ứng bậc 2 và Xác định hàm lượng collagen: Hàm lượng Turkey. Các đồ thị được vẽ được trên phần collagen = Hàm lượng hydroxyproline × 14,7 mềm Microsoft Office Excel 2010. Sử dụng [26]. Hàm lượng hydroxyproline được xác định phần mềm Design Expert 6 để xác định các bằng sắc ký khí. Phương pháp này được xác thông số tối ưu của quy trình xử lý và tách chiết định theo Kechaou et al., [27]. collagen. Xác định hàm lượng protein: Hàm lượng Xác định hiệu suất khử protein phi collagen protein được xác định bằng phương pháp và hiệu suất khử lipit: bicinchoninic acid (BCA) theo Smith et al., mm [28]. 12 Y1% 100 Xác định hàm lượng lipit: Được xác định m1 theo phương pháp của Bligh và Dyer [29]. Độ nhớt: được thực hiện trên một máy đo độ Trong đó: Y1 là hiệu suất khử protein phi nhớt DV- I Prime BROOKFIELD của Hoa Kỳ. collagen/lipit; m1 là hàm lượng protein/lipit trong da cá trước xử lý; m là hàm lượng Xác định độ trắng của da cá: Bằng máy đo 2 protein/lipit trong da sau xử lý. màu Chroma meter CR-400. Phương pháp xử lý số liệu Hiệu suất khử protein phi collagen/lipit là Tất cả các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Số tốt nhất khi hàm Y1 có giá trị lớn nhất. liệu thí nghiệm được trình bày dưới dạng giá trị Xác định hiệu suất thu hồi collagen: trung bình ± SE. Phân tích thống kê được thực m2 hiện trên phần mềm R. Sự sai khác của các giá Y2 % 100 trị trung bình của số liệu thí nghiệm được phân m1 145
  6. Doan Thi Thiet et al. Trong đó: Y2 là hiệu suất thu hồi collagen; m1 là Kết quả phân tích ANOVA cho thấy tương khối lượng da cá ban đầu đưa vào tách chiết tác giữa các biến: Nồng độ NaOH (X1 - M), collagen; m2 là hàm lượng collagen thu được thời gian xử lý (X2 - giờ), tỷ lệ ngâm da cá/dung sau tách chiết. dịch (X3 - g/ml) và bình phương của chúng Hiệu suất thu hồi collagen là cao nhất khi trong mô hình hồi quy bậc 2 với hiệu suất khử hàm Y2 có giá trị lớn nhất. PPC (Y1) là có ý nghĩa (p < 0,05). Mô hình này được xây dựng như sau: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Xác định chế độ xử lý NaOH tách tạp chất Y1 = 82,15 + 12,93X1 + 5,93X2 + 7,51X3 – 2 2 2 Kết quả xác định mô hình hồi quy cho hàm 10,49X1 – 8,17X2 – 9,83X3 + 1,67X1X2 + mục tiêu hiệu suất khử protein phi collagen 1,5X1X3 + 1,5X2X3 Hình 2. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH, thời gian xử lý và tỷ lệ ngâm da cá/dung dịch đến hiệu suất khử PPC Bề mặt đáp ứng miêu tả ảnh hưởng của trong khoảng thời gian từ 48–60 giờ và nồng độ nồng độ NaOH và thời gian xử lý tới hiệu suất NaOH từ 0,14–0,17M, đồng thời tỷ lệ ngâm da khử PPC được thể hiện trên hình 2. cá/dung dịch trong khoảng 1/10 đến 1/13 thì Kết quả thực nghiệm cho thấy khi thời gian hiệu suất khử PPC là cao nhất, nếu tỷ lệ ngâm xử lý vượt quá 63 giờ thì hiệu suất khử protein thấp quá thì quá trình khử PPC sẽ không triệt phi collagen (PPC) tăng không đáng kể. Nồng để và nếu tỷ lệ cao quá thì sẽ gây lãng phí. độ NaOH cũng ảnh hưởng rõ rệt tới hiệu suất Kết quả xác định mô hình hồi quy cho hàm khử PPC, hiệu suất khử PPC tăng khi nồng độ mục tiêu hiệu suất khử lipit NaOH tăng tới khoảng 0,16M. Nhưng khi nồng Kết quả phân tích ANOVA cho thấy tương độ NaOH vượt quá 0,16M thì hiệu suất khử tác giữa các biến: nồng độ NaOH (X1 - M), thời PPC không tăng nữa mà có xu hướng giảm dần. gian xử lý (X2 - giờ), tỷ lệ ngâm da cá/ dung Như vậy, hiệu suất khử PPC đạt hiệu quả cao dịch (X3 - g/ml) và bình phương của chúng 146
  7. Optimizing conditions for treatment and extraction trong mô hình hồi quy bậc 2 cho hiệu suất khử Y1 = 78,75 + 10,40X1 + 5,33X2 + 6,65X3 – 2 2 2 lipit (Y2 - %) là có ý nghĩa (p < 0,05). Vậy mô 7,86X1 – 7992 – 972X3 + 3X1X2 + 0,4X1X3 + hình này được xây dựng như sau: 0,25X2X3 Hình 3. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH, thời gian và tỷ lệ ngâm đến hiệu suất khử lipit Bề mặt đáp ứng miêu tả ảnh hưởng của Kết quả phân tích thống kê cũng cho thấy sự nồng độ NaOH và thời gian xử lý tới hiệu suất khác biệt về hiệu suất khử PPC và hiệu suất khử lipit được thể hiện trên hình 3. khử lipit ở nồng độ 0,15M so với các nồng độ Kết quả phân tích cho thấy khi nồng độ 0,14M và 0,16M là có ý nghĩa thống kê với P NaOH càng lớn và thời gian xử lý càng dài thì < 0,05. hiệu suất khử lipit càng cao. Từ các phân tích ở So sánh với các nghiên cứu collagen từ phụ trên cho thấy hiệu suất khử lipit đạt hiệu quả phẩm của các loài cá biển khác ta thấy hầu hết cao khi thời gian xử lý lớn hơn 50 giờ và nồng các tác giả đều sử dụng NaOH nồng độ trong độ NaOH lớn hơn 0,14M. khoảng 0,1–0,15M để xử lý da cá. Cụ thể, Li et Tối ƣu thông số cho công đoạn khử tạp chất al., [30] đã sử dụng NaOH 0,1 N tỷ lệ 1/10 phi collagen g/ml và thời gian ngâm khử là 48 giờ để xử lý Kết quả thực nghiệm kiểm chứng số liệu da cá thu (Scomberomorous niphonius). tối ưu hóa theo các thông số với 3 lần lặp lại Benjakul et al., [17] đã xử lý da cá tráp mắt to cho thấy ở nồng độ 0,15M, tỷ lệ ngâm da (Priacanthus tayenus) bằng NaOH 0,1M trong cá/dung dịch 1/13,9 g/ml và thời gian xử lý là 6 giờ. Ngoài ra, nồng độ và tỷ lệ NaOH để xử 56,9 giờ thì cho hiệu suất khử PPC và hiệu lý bong bóng bơi của cá ngừ vây vàng suất khử lipit là cao nhất, tương ứng 87,13% (Thunnus albacares) cũng tương đồng với kết và 82,3% (bảng 3). Do đó, chúng tôi chọn chế quả nghiên cứu trong bài báo này, tuy nhiên độ xử lý da cá bò gai móc bằng NaOH nồng thời gian xử lý thành phần PPC của loài này chỉ độ 0,15M, thời gian ngâm chiết là 56,9 giờ, tỷ trong 2 giờ ngắn hơn so với thời gian xử lý da lệ ngâm da cá/dung dịch NaOH là 1/13,9 g/ml. cá bò gai móc [31]. 147
  8. Doan Thi Thiet et al. Bảng 3. Kết quả dự đoán thông số tối ưu công đoạn khử tạp chất collagen Các yếu tố ảnh hưởng Kết quả dự đoán Kết quả thực nghiệm Nồng độ Thời gian xử Tỷ lệ ngâm Hiệu suất khử Hiệu suất khử Hiệu suất khử Hiệu suất khử lipit NaOH (M) lý (giờ) (g/ml) PPC (%) lipit (%) PPC (%) (%) 0,14 60,3 1/14,4 79,21 69,90 79,92b 75,00a 0,15 56,9 1/13,9 86,13 81,90 87,13a 82,30b 0,16 55,6 1/12,7 81,50 77,44 81,90b 77,44c Ghi chú: Các kí tự khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở p và hình 5. 0,05). Do đó, thời gian ngâm H2O2 thích hợp để Thực nghiệm cho thấy độ trắng cao nhất là tẩy màu cho da cá là 10 phút. 50,84w khi ngâm H2O2 ở nồng độ 6%. Tuy Ngoài ra, khi xử lý da cá bằng H2O2 ở thời nhiên khi ngâm da cá ở nồng độ H2O2 8% thì gian ngâm 5 phút và 10 phút thì độ nhớt của độ trắng da cá có xu hướng giảm. Điều này cho dung dịch sau xử lý tương ứng chỉ 1,13 cP và thấy xử lý H2O2 nồng độ 6% cho độ trắng tốt 1,16 cP, lúc này da cá còn nguyên miếng, hơn so với các nồng độ còn lại. Khi xử lý da cá nhưng khi xử lý da cá bằng H2O2 thời gian 15 bằng H2O2 ở nồng độ 2% và 4% thì độ nhớt của phút và 20 phút thì độ nhớt dung dịch sau xử lý dung dịch sau xử lý khá thấp, tương ứng chỉ tăng lên 1,69 cP và 2,19 cP, da cá mềm và nhũn 1,09 cP và 1,14 cP, khi xử lý da cá bằng H2O2 hơn. Do đó, thời gian ngâm H2O2 thích hợp để nồng độ 6% thì độ nhớt dung dịch sau xử lý là tẩy màu cho da cá bò gai móc là 10 phút. 1,25 cP. Ở nồng độ H2O2 8%, độ nhớt của dung Độ trắng da cá cao nhất là 42,43w khi ngâm dịch sau xử lý là 1,53 cP, tăng cao hơn so với ở tỷ lệ 1/2 g/ml. Ở tỷ lệ ngâm 1/3 g/ml và 1/4 H2O2 6%, nhưng ở nồng độ này da cá trở nên g/ml thì độ trắng da cá giảm dần. Ngoài ra có sự mềm hơn và dễ gây thất thoát collagen trong khác nhau có ý nghĩa ở tỷ lệ ngâm 1/1 g/ml và quá trình xử lý. Do đó nồng độ H2O2 thích hợp 1/2 g/ml. Bên cạnh đó ở tỷ lệ ngâm da cá/dung để tẩy màu cho da cá bò gai móc trong quá dịch H2O2 càng cao thì độ nhớt của dung dịch trình sản xuất collagen là 6%. tăng dần, tuy nhiên đến tỷ lệ 1/4 thì độ nhớt Độ trắng da cá cao nhất là ở thời gian ngâm giảm. Do đó, tỷ lệ ngâm da cá/ H2O2 thích hợp 15 phút, nhưng đến 20 phút thì độ trắng giảm để tẩy màu cho da cá bò gai móc là 1/2 g/ml. (a) (b) (c) Hình 4. Ảnh hưởng của nồng độ, tỷ lệ và thời gian tẩy màu bằng H2O2 đến độ trắng da cá: (a): Ảnh hưởng của nồng độ ngâm H2O2 ở thời gian ngâm 10 phút và tỷ lệ ngâm 1/2 g/ml; (b): Ảnh hưởng của thời gian ngâm H2O2 ở nồng độ 6% và tỷ lệ ngâm 1/2 g/ml; (c): Ảnh hưởng của tỷ lệ ngâm H2O2 ở nồng độ 6% và thời gian 10 phút. Các kí tự khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở P < 0,05 148
  9. Optimizing conditions for treatment and extraction 2,5 1,4 1,8 1,6 1,35 1,4 1,3 1,2 1,5 1,25 0,8 0,6 1,2 0,4 0,5 1,15 0,2 1,1 (a) (b) (c) Hình 5. Ảnh hưởng của nồng độ, tỷ lệ và thời gian tẩy màu bằng H2O2 đến đến độ nhớt của dung dịch sau xử lý: (a): Ảnh hưởng của nồng độ ngâm H2O2 ở thời gian ngâm 10 phút và tỷ lệ ngâm 1/2 g/ml; (b): Ảnh hưởng của thời gian ngâm H2O2 ở nồng độ 6% và tỷ lệ ngâm 1/2 g/ml; (c): Ảnh hưởng của tỷ lệ ngâm H2O2 ở nồng độ 6% và thời gian 10 phút. Các kí tự khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở P < 0,05 Các loại da các khác nhau thì có chế độ khử Thời gian chiết cũng ảnh hưởng đến hiệu màu khác nhau, đối với cá hồi (Oncorhynchus suất thu hồi collagen, hiệu suất chiết tăng rõ rệt mykiss) thì được ngâm khử H2O2 10%, tỷ lệ da khi thời gian chiết tăng từ 34 giờ đến khoảng cá/ dung dịch là 1/1 g/ml, thời gian ngâm khử 55 giờ . Tuy nhiên khi chiết ở thời gian quá lâu, H2O2 là 10 phút [23]. Trong khi đó Zang et al., vượt quá 72 giờ thì hiệu suất thu hồi collagen [21] tẩy màu cá da trơn (Mystus macropterus) có xu hướng giảm. bằng H2O2 3%, và thời gian ngâm khử là 24 h. Như vậy, có thể thấy rằng hiệu suất chiết Xác định chế độ chiết collagen bằng acid collagen đạt giá trị cao khi thực hiện quá trình acetic chiết với nồng độ acid acetic từ 0,46–0,58M và Xác định mô hình hồi quy cho hàm mục tiêu thời gian chiết từ 50–62 giờ. Tỷ lệ chiết cũng hiệu suất thu hồi collagen ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi collagen, ở tỷ Kết quả phân tích ANOVA cho thấy tương lệ 1/8 - 1/10 g/ml thì hiệu suất thu hồi collagen là cao nhất, nếu tỷ lệ dung dịch ngâm chiết quá tác giữa các biến: nồng độ CH3COOH (X1 - M), ít thì sẽ không chiết được hoàn toàn collagen thời gian xử lý (X2 - giờ), tỷ lệ ngâm chiết da cá/dung dịch (X3 - g/ml) và tương tác giữa trong da cá, tuy nhiên nếu cao quá thì sẽ gây chúng trong mô hình hồi quy bậc 2 của hàm lãng phí dung môi. mục tiêu hiệu suất chiết collagen (Y1 - %) là có Xác định mô hình hồi quy cho hàm mục tiêu ý nghĩa (p = 0,05). Mô hình này được xây dựng độ nhớt collagen như sau: Kết quả suy diễn phương trình hồi quy hàm 2 Y1 = 15,43 – 2,56X1 + 1,07X2 + 1,04X3 – 2,24X1 – mục tiêu độ nhớt colagen tổng thể (p < 0,05) 2 2 1,86X2 – 2,35X3 + 0,41X1X2 + 0,44X1X3 – như sau: 0,44X X 2 2 3 Y1 = 7,42– 0,77X1 – 0,41X2 + 0,015X3 – 0,86X1 – 2 2 Kết quả tính toán từ mô hình (hình 6) cho 0,54X2 – 0,43X3 + 0,05X1X2 – 0,09X1X3 – thấy hiệu suất chiết collagen tăngkhi nồng độ 0,05X2X3 acid đạt khoảng 0,46–0,58M Chứng tỏ ở Trong đó: Y là độ nhớt collagen (%), X là khoảng nồng độ này sẽ tạo ra môi trường pH 1 1 nồng độ acid acetic (M), X là thời gian chiết thích hợp nhất cho quá trình tách chiết collagen 2 (giờ), X là tỷ lệ chiết (g/ml). ra khỏi da cá. Tuy nhiên nếu tiếp tục tăng nồng 3 độ acid cao hơn, vượt quá nồng độ tối ưu thì Kết quả tính toán từ mô hình (hình 7) cho hiệu suất chiết thu hồi collagen lại giảm. thấy, khi thời gian chiết ngắn và nồng độ acid 149
  10. Doan Thi Thiet et al. thấp thì độ nhớt collagen sẽ cao hơn khi chiết hiện quá trình chiết collagen với điều kiện nồng collagen ở nồng độ acid cao và thời gian dài. Ở độ acid acetic nhỏ hơn 0,6M và thời gian chiết nồng độ acid lớn hơn 0,65M và thời gian chiết ngắn hơn 72 giờ thì sẽ thu được collagen có độ lâu hơn 68 giờ cho thấy sự giảm mạnh về độ nhớt cao hơn. nhớt của sản phẩm collagen. Như vậy, thực Hình 6. Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic, thời gian và tỷ lệ chiết đến hiệu suất collagen Hình 7. Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic, thời gian và tỷ lệ chiết tới độ nhớt collgen 150
  11. Optimizing conditions for treatment and extraction Bảng 4. Kết quả dự đoán thông số tối ưu công đoạn chiết collagen Các yếu tố ảnh hưởng Kết quả dự đoán Kết quả thực nghiệm Nồng độ acid Thời gian xử Tỷ lệ ngâm Hiệu suất thu hồi Độ nhớt Hiệu suất thu Độ nhớt acetic (M) lý (giờ) chiết (g/ml) collagen (%) collagen (cP) hồi collagen (%) collagen (cP) 0,53 59,6 1/9,6 16,20 6,88 16,01a 7,02a 0,55 56,4 1/9,7 16,02 6,69 13,18b 5,93b 0,57 55,1 1/9,8 15,98 6,72 13,22b 6,23c Ghi chú: Các kí tự khác nhau thể hiện sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở P 0,05). Do hiệu suất tách chiết 0,37% (% trọng lượng đó, nồng độ NaCl 3M được chọn là nồng độ kết khô). Nagai và cộng sự [7] tách chiết collagen tủa collagen tốt nhất. (a) (b) Hình 8. Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian kết tủa collagen bằng NaCl, (a): Ảnh hưởng của nồng độ; (b): Ảnh hưởng của thời gian Kết quả ở hình 8a cho thấy nồng độ muối là 3,1 g và khi tăng nồng độ muối ăn lên 4M thì có ảnh hưởng rõ rệt tới lượng kết tủa collagen lượng tủa thu được 6,01 g. Khi nồng độ muối thu được và nồng độ muối càng cao thì lượng thấp thì kết tủa hình thành dạng nhũ tương với kết tủa thu được càng lớn. Khi nồng độ NaCl lượng kết tủa không nhiều và rất khó tách khỏi sử dụng là 1M thì khối lượng tủa thu được chỉ dung dịch. Kết quả phân tích thống kê cũng cho 151
  12. Doan Thi Thiet et al. thấy không khác biệt về khối lượng tủa thu [4] Kim, H. K., Kim, Y. H., Park, H. J., and được ở nồng độ 3M so với 4M (P > 0,05). Do Lee, N. H., 2013. Application of đó, nồng độ NaCl 3M được chọn là nồng độ kết ultrasonic treatment to extraction of tủa collagen tốt nhất. collagen from the skins of sea bass Kết quả trình bày ở hình 8b cho thấy thời Lateolabrax japonicus. Fisheries Science, gian tủa có ảnh hưởng rõ rệt tới khối lượng kết 79(5), 849–856. Doi: 10.1007/s12562- tủa collagen thu được và thời gian kết tủa càng 013-0648-z. dài thì khối lượng kết tủa thu được càng lớn. [5] Yamada, S., Yamamoto, K., Ikeda, T., Cụ thể, ở thời gian tủa 5 phút thì khối lượng tủa Yanagiguchi, K., and Hayashi, Y., 2014. thu được là 3,06 g, thời gian tủa 20 phút thì Potency of fish collagen as a scaffold for khối lượng tủa thu được 6,4 g. Kết quả phân regenerative medicine. BioMed Research tích thống kê cũng cho thấy không khác biệt về International, 2014, 302932. khối lượng tủa thu được ở thời gian 15 phút so với 20 phút (P > 0,05). Do đó, thời gian 15 phút [6] Li, Z., Liu, J. Z., Wang, Y. J., Liu, S. H., được chọn là thời gian kết tủa collagen thích and Sun, M., 2013. Comparison between hợp nhất. thermal hydrolysis and enzymatic proteolysis processes for the preparation KẾT LUẬN of tilapia skin collagen hydrolysates. Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ Czech Journal of Food Sciences, 31(1), 1– NaOH 0,15M, tỷ lệ 1/13,9 g/ml, thời gian 56,9 4. giờ và nồng độ H2O2 6%, tỷ lệ da cá/ dung dịch [7] Nagai, T., Araki, Y., and Suzuki, N., H2O2 là 1/2 g/ml, thời gian 10 phút là tối ưu 2002. Collagen of the skin of ocellate cho việc khử tạp chất phi collagen và tẩy màu puffer fish (Takifugu rubripes). Food da cá. Việc sử dụng nồng độ acid acetic 0,53M, chemistry, 78(2), 173–177. tỷ lệ 1/9,6 g/ml trong thời gian 59,6 giờ là tối 10.1016/S0308-8146(01)00396-X. ưu để tách chiết và NaCl 3M trong 15 phút là [8] Sadowska, M., Kołodziejska, I., and tối ưu để tách chiết để thu hồi collagen. Niecikowska, C., 2003. Isolation of collagen from the skins of Baltic cod Lời cảm ơn: Bài báo được hỗ trợ của đề tài (Gadus morhua). Food Chemistry, 81(2), VAST, Mã số: VAST 04.04/15–16. Tác giả 257–262. chân thành cảm ơn Ths. Lê Thị Thu Thảo, 8146(02)00420-X. phòng Động vật có xương sống biển, đã hỗ tợ [9] Nishimoto, M., Mizuta, S., and trong việc định danh loài cá này. Yoshinaka, R., 2004. Characterization of molecular species of collagen in muscles TÀI LIỆU THAM KHẢO of Japanese amberjack, Seriola [1] Birk, D. E., and Bruckner, P., 2005. quinqueradiata. Food Chemistry, 84(1), Collagen Suprastructures. Collagen: 127–132. Primer in Structure, Processing and 8146(03)00183-3. Assembly, 247, 185–205. [10] Senaratne, L. S., Park, P. J., and Kim, S. [2] Silva, T. H., Moreira-Silva, J., Marques, K., 2006. Isolation and characterization A. L., Domingues, A., Bayon, Y., and of collagen from brown backed toadfish Reis, R. L., 2014. Marine origin collagens (Lagocephalus gloveri) skin. and its potential applications. Marine Bioresource Technology, 97(2), 191–197. drugs, 12(12), 5881–5901. 10.3390/md12125881. 024. [3] Benjakul, S., Nalinanon, S., and Shahidi, [11] Di, Y. U., Chang-Feng, C. H. I., Bin, W. F., 2012. Fish collagen. Food Biochemistry A. N. G., Guo-Fang, D. I. N. G., and and Food Processing, 365–387. Zhong-Rui, L. I., 2014. Characterization of acid-and pepsin-soluble collagens from h20. spines and skulls of skipjack tuna 152
  13. Optimizing conditions for treatment and extraction (Katsuwonus pelamis). Chinese Journal of acid and pepsin-solubilised collagens from Natural Medicines, 12(9), 712–720. the skin of Brownstripe red snapper (Lutjanus vitta). Food Chemistry, 93(3), 110-2. 475–484. [12] Sankar, S., Sekar, S., Mohan, R., Rani, S., foodchem.2004.10.026. Sundaraseelan, J., and Sastry, T. P., 2008. [19] Nalinanon, S., Benjakul, S., Preparation and partial characterization of Visessanguan, W., and Kishimura, H., collagen sheet from fish (Lates calcarifer) 2008. Tuna pepsin: characteristics and its scales. International Journal of use for collagen extraction from the skin Biological Macromolecules, 42(1), 6–9. of threadfin bream (Nemipterus spp.). Journal of Food Science, 73(5), C413– .003. C419. [13] Muralidharan, N., Shakila, R. J., Sukumar, 3841.2008.00777.x. D., and Jeyasekaran, G., 2013. Skin, bone [20] Nalinanon, S., Benjakul, S., and and muscle collagen extraction from the Kishimura, H., 2010. Collagens from the trash fish, leather jacket (Odonus niger) skin of arabesque greenling and their characterization. Journal of (Pleurogrammus azonus) solubilized with Food Science and Technology, 50(6), the aid of acetic acid and pepsin from 1106–1113. albacore tuna (Thunnus alalunga) s13197-011-0440-y. stomach. Journal of the Science of Food [14] Jeong, H. S., Venkatesan, J., and Kim, S. and Agriculture, 90(9), 1492–1500. K., 2013. Isolation and characterization of collagen from marine fish (Thunnus [21] Zhang, M., Liu, W., and Li, G., 2009. obesus). Biotechnology and Bioprocess Isolation and characterisation of Engineering, 18(6), 1185–1191. Doi: collagens from the skin of largefin 10.1007/s12257-013-0316-2. longbarbel catfish (Mystus macropterus). [15] Okazaki, E., and Osako, K., 2014. Food Chemistry, 115(3), 826–831. Isolation and characterization of acid- soluble collagen from the scales of marine fishes from Japan and Vietnam. Food 1.006. Chemistry, 149, 264–270. [22] Xu, S., Yang, H., Shen, L., and Li, G., 10.1016/j.foodchem.2013.10.094. 2017. Purity and yield of collagen [16] Tuan, P. D., and Dzung, N. H., 2014. extracted from southern catfish (Silurus Extraction and isolation of collagen from meridionalis Chen) skin through improved the skins of basa fish (Pangasius pretreatment methods. International hypophthalmus). Vietnam Journal of Journal of Food Properties, 20(Sup1), Science and Technology, 52(4), 431–440. S141–S153. [17] Benjakul, S., Thiansilakul, Y., 10942912.2017.1291677. Visessanguan, W., Roytrakul, S., [23] Le, P. T. H., Tran, Q. T., 2017. Extraction Kishimura, H., Prodpran, T., and of collagen from salmon skin Meesane, J., 2010. Extraction and (Oncorhynchus mykiss) by chemical characterisation of pepsin‐solubilised method. Journal of Food Science and collagens from the skin of bigeye snapper Technology, 12, 108–117. (Priacanthus tayenus and Priacanthus [24] Le, T. T. T., Vo, V. Q., Nguyen, P. U. V., macracanthus). Journal of the Science of Tran, T. H. H., Tran, C. T., 2015. Food and Agriculture, 90(1), 132–138. Investigation and make up collection of common and rare fish in the South Central [18] Jongjareonrak, A., Benjakul, S., Coast. Scientific Report sponsored by Visessanguan, W., Nagai, T., and Tanaka, IOC/UNESCO, Institute of Oceanography, M., 2005. Isolation and characterisation of Nha Trang. 153
  14. Doan Thi Thiet et al. [25] George, E. P., Hunter, J. S., Hunter, W. acid. Analytical Biochemistry, 150(1), 76– G., Bins, R., Kirlin IV, K., and Carroll, 85. D., 2005. Statistics for experimenters: 90442-7. design, innovation, and discovery (pp. [29] Bligh, E. G., and Dyer, W. J., 1959. A 235–273). New York, NY, USA: Wiley. rapid method of total lipid extraction and [26] Anonymous, 1978. Meat and meat purification. Canadian Journal of products‐determination of L (‐) Biochemistry and Physiology, 37(8), 911– hydroxyproline content (reference 917. method). Int Stand ISO, 3496(E). [30] Li, Z. R., Wang, B., Chi, C. F., Zhang, Q. [27] Kechaou, E. S., Dumay, J., Donnay- H., Gong, Y. D., Tang, J. J., and Ding, Moreno, C., Jaouen, P., Gouygou, J. P., G. F., 2013. Isolation and characterization Bergé, J. P., and Amar, R. B., 2009. of acid soluble collagens and pepsin Enzymatic hydrolysis of cuttlefish (Sepia soluble collagens from the skin and bone officinalis) and sardine (Sardina of Spanish mackerel (Scomberomorous pilchardus) viscera using commercial niphonius). Food Hydrocolloids, 31(1), proteases: Effects on lipid distribution and 103–113. amino acid composition. Journal of yd.2012.10.001. Bioscience and Bioengineering, 107(2), [31] Kaewdang, O., Benjakul, S., Kaewmanee, 158–164. T., and Kishimura, H., 2014. 2008.10.018. Characteristics of collagens from the [28] Smith, P. E., Krohn, R. I., Hermanson, G. swim bladders of yellowfin tuna (Thunnus T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., albacares). Food Chemistry, 155, 264– Provenzano, M., and Klenk, D. C., 1985. 270. Measurement of protein using bicinchoninic 2014.01.076. 154