Using dna barcodes to identify thai nguyen catfish

Nội dung text: Using dna barcodes to identify thai nguyen catfish

1. TNU Journal of Science and Technology 226(10): 3 - 8 USING DNA BARCODES TO IDENTIFY THAI NGUYEN CATFISH Hoang Thi Thu Yen*, Nguyen Thi Yen TNU - University of Sciences ARTICLE INFO ABSTRACT Received: 23/02/2021 The mitochondrial cytochrome c oxidase subunite I (COI) gene has been used extensively to study molecular taxonomy in animals. In this Revised: 24/3/2021 study, we study the sequencing analysis of COI gene segments Published: 28/5/2021 isolated from Thai Nguyen catfish sample. COI gene fragment was isolated from catfish genome DNA by PCR technique. Then, the PCR KEYWORDS product was purified and sequenced, the COI gene segment obtained was 616 bp in length. Nucleotide sequences of COI gene were Catfish compared with those published on Genbank using Blast software. The Catfish genus Silurus comparison results showed that the studied COI gene segment did Mitochondrial DNA nothave scientific basis to identify species in the genus Silurus. Using Bioedit software to compare the nucleotide sequence of the COI gene Gene coding cytochrome c fragment showed that the studied catfish sample could be a different oxidase subunit I (COI) species compared with the submitted species belonging genus Silurus. Molecular taxonomy SỬ DỤNG MÃ VẠCH DNA TRONG VIỆC ĐỊNH LOẠI CÁ NHEO TẠI THÁI NGUYÊN Hoàng Thị Thu Yến*, Nguyễn Thị Yến Trường Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên THÔNG TIN BÀI BÁO TÓM TẮT Ngày nhận bài: 23/02/2021 Gen mã hóa cytochrome c oxidase subunit I (COI) ở ty thể được sử dụng nhiều để nghiên cứu phân loại phân tử ở động vật. Trong Ngày hoàn thiện: 24/3/2021 nghiên cứu này, chúng tôi phân tích trình tự đoạn gen COI phân lập Ngày đăng: 28/5/2021 từ mẫu cá nheo Thái Nguyên. Đoạn gen COI được phân lập từ DNA genome mẫu cá nheo bằng kỹ thuật PCR. Sau đó, sản phẩm PCR TỪ KHÓA được tinh sạch và xác định trình tự, đoạn gen COI thu được có chiều dài 616 bp. Trình tự nucleotide đoạn gen COI được so sánh với các Cá nheo trình tự đã công bố trên Genbank bằng cách sử dụng phần mềm Chi cá nheo Silurus Blast. Kết quả so sánh chỉ ra, đoạn gen COI nghiên cứu không có cơ DNA ty thể sở khoa học để định danh đến loài trong chi cá nheo Silurus. Sử dụng phần mềm Bioedit so sánh trình tự nucleotide đoạn gen COI cho Gen mã hóa cytochrome c oxidase thấy, mẫu cá nheo nghiên cứu có thể là 1 loài khác so với các loài đã subunit I (COI) công bố thuộc chi cá nheo Silurus. Phân loại phân tử DOI: *Corresponding author. Email:yenhtt@tnus.edu.vn 3 Email: jst@tnu.edu.vn
2. TNU Journal of Science and Technology 226(10): 3 - 8 1. Mở đầu Hiện nay, ngoài các nghiên cứu phân tích về đặc điểm hình thái, các phương pháp nghiên cứu di truyền phân loại phân tử cũng được sử dụng nhằm hỗ trợ nhận dạng và định danh loài. Tất cả các tế bào sinh vật nhân chuẩn đều có chứa ty thể, DNA ty thể có tốc độ thay đổi nhanh, chúng cung cấp những sai khác quan trọng trong trình tự giữa các loài [1]. Một số gen ty thể được sử dụng nhiều để nghiên cứu và ứng dụng trong phân loại phân tử có thể kể đến như cytochrome c oxidase subunit I (COI) và 16S rRNA [2]-[4]. Cơ sở dữ liệu Fishbase cho thấy, cá nheo chi Silurus có 14 loài thuộc họ Siluridae, bộ Siluriformes, lớp Actinopterygii, ngành Chordata và giới Animalia [5]. DNA ty thể của một số loại cá nheo đã được công bố trên Genbank (Silurus soldatovi - MN171302; Silurus asotus - MK895951; Silurus grahami- MW217571 ). Năm 2012, Wang và cs đã nghiên cứu đa dạng di truyền rRNA 16S từ 18 mẫu cá nheo được thu thập từ các con sông ở Trung Quốc và chỉ ra chúng có mức tương đồng di truyền cao, dao động 99,8-100% [6]. Năm 2015, dựa trên các quan sát về hình thái, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Hảo cho rằng Việt Nam có 3 loài cá nheo mới, nâng tổng số loài cá nheo lên 5. Đó là, S. caobangensis sp.n. thu ở sông Bằng (Cao Bằng), S. langsonensis sp. n. thu ở sông Kỳ Cùng (Lạng Sơn) và S. dakrongensis sp. n thu ở sông Đakrông (Quảng Trị). Hai loài được công bố trước đó là cá nheo S. asotus Linneaus, 1758 phân bố rộng ở các tỉnh phía Bắc, S. meridionalis Chen, 1977 phân bố ở sông Kỳ Cùng (Lạng Sơn)[7] . Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đặc điểm trình tự đoạn gen COI phân lập từ mẫu cá nheo Thái Nguyên làm cơ sở khoa học để định danh loài cá nheo. 2. Nguyên liệu và phương pháp 2.1. Nguyên liệu Sử dụngm ẫu vây cá nheo được thu thập tại sông Công, TP. Sông Công, Thái Nguyên. 2.2. Phương pháp 2.2.1. Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số được tách chiết bằng cách sử dụng bộ kit DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen, Thượng Hải, Trung Quốc). Mẫu vây cá nheo được cắt nhỏ, cho vào ống eppendorf 1,5ml; nghiền trong ni tơ lỏng. Tiếp theo, bổ sung 20l proteinase K, đảo đều và ủ mẫu ở 560C trong 3h; thêm 4l RNase, trộn đều, giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Trộn đều hỗn hợp trong 15 giây, bổ sung 200l dung dịch AL, đảo đều; bổ sung 200l ethanol tuyệt đối, đảo đều. Chuyển dung dịch sang cột, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch. Chuyển cột sang ống mới, bổ sung 500 l dung dịch AW1, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột sang ống mới, bổ sung 500 l dung dịch AW2, ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút. Loại bỏ dịch và ly tâm thêm 14000 vòng/phút trong 1 phút để làm khô mẫu. Đặt cột sang ống eppendorf mới, bổ sung 50l nước khử ion, ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút. Bước này lặp lại hai lần. Mẫu DNA tổng số sau đó được kiểm tra bằng điện di gel 0,8%. 2.2.2. Phân lập đoạn gen COI bằng kỹ thuật PCR Cặp mồi sử dụng trong kỹ thuật PCR khuếch đại đoạn gen COI dựa trên cơ sở dữ liệu trình tự đã công bố của loài Silurus soldatovi - MN171302; Silurus asotus - MK895951 và Silurus grahami- MW217571 (F: 5’-CACGCGCTGATTCTTCTCAACTAAC-3’ và R: 5’- CCGGGTAGAATCAGAATGTAGACTTC-3’). Kỹ thuật PCR được thực hiện trong 50 l thể tích với các thành phần: 25 l master mix (Qiagen), 2,0 l mồi F (10mM), 2,0 l mồi F (10mM), 0 0 4 l DNA(40 ng/l); 17 l H2O. Chu trình nhiệt của phản ứng là: 94 C trong 3 phút, (94 C trong 30 giây, 580C trong 45 giây, 720C trong 45 giây) lặp lại 32 chu kỳ, 720C trong 10 phút và lưu giữ 4 Email: jst@tnu.edu.vn
3. TNU Journal of Science and Technology 226(10): 3 - 8 ở 40C. Sản phẩm PCR được kiểm tra trên gel agarose 1%. Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng kit JETTM PCR purification của Thermo Scientific (Hoa Kỳ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 2.2.3. Xác định và phân tích trình tự đoạn gen COI Sản phẩm PCR đoạn gen COI tinh sạch được xác định trình tự trên máy ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Anlalyzer (Applied Biosystems). Kết quả trình tự gen được phân tích, so sánh bằng phần mềm sinh học chuyên dụng (BLAST, Bioedit). 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Khuếch đại và xác định trình tự đoạn gen COI từ mẫu cá nheo nghiên cứu Từ DNA tổng số thu được, chúng tôi tiến hành khuếch đại đoạn gen COI với cặp mồi dựa trên trình tự gen đã công bố trên Genbank. Sản phẩm của phản ứng PCR đượcđiện di kiểm tra trên gel agarose 1%, kết quả thu được thể hiện trên hình 1. Hình 1. Hình ảnh điện di kết quả PCR khuếch đại đoạn gen COI từ mẫu cá nheo nghiên cứu (M: Ladder GeneRuler 1 kb (Thermo Scientific); 1: sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen COI từ mẫu cá nheo nghiên cứu Kết quả ở hình 1 cho thấy, sản phẩm PCR đoạn gen COI thu được có kích thước khoảng 0,7 kb, kích thước này phù hợp theo tính toán lý thuyết. Tiếp theo, sản phẩm PCRđược tinh sạch phục vụ mục đích xác định trình tự, kết quả thu được đoạn trình tự nucleotide sản phẩm PCR có kích thước 616 bp và so sánh với các trình tự đã công bố trên Genbank bằng cách sử dụng phần mềm Blast. Kết quả so sánh cho thấy, sản phẩm PCR được khuếch đại chính là đoạngenCOI, phân tích bằng phần mềm Bioedit cho thấy đoạn genCOI có khung đọc từ nucleotide thứ 3, mã hóa 204 amino acid (hình 2). 3.2. Phân tích trình tự nucleotide sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen COI Để xác định đoạn trình tự sản phẩm PCR thu được có phải đoạn gen COI hay không, chúng tôi sử dụng phần mềm Blast để so sánh đoạn trình tự thu được với các trình tự đã được công bố trên Genbank. Kết quả phân tích blast cho thấy, trình tự nucleotide thu được chính là trình tự một phần của gen COI. Mặt khác, để tìm hiểu trình tự đoạn gen COI từ mẫu nghiên cứu có thể đóng vai trò là DNA barcoding trong định danh loài cá nheo dựa trên phần mềm blast, các nucleotide tương đồng được xác định cùng với các thông số: Coverage (độ bao phủ theo chiều dài của trình tự so sánh); E- value (giá trị này càng nhỏ thì độ tin cậy càng cao) và Identity (độ tương đồng so với trình tự so sánh). Một phần dữ liệu tương đồng nhất của một số loài thuộc chi cá nheo Silurus với trình tự mẫu nghiên cứu được thể hiện trên bảng 1. 5 Email: jst@tnu.edu.vn
4. TNU Journal of Science and Technology 226(10): 3 - 8 10 20 30 40 50 60 70 80 90 | | | | | | | | | | | | | | | | | | TAGTCGGCACAGCTTTAAGTCTCCTAATCCGAGCGGAGCTGGCCCAACCTGGCGCCCTCCTAGGCGACGATCAAATCTACAACGTCATCGTT V G T A L S L L I R A E L A Q P G A L L G D D Q I Y N V I V 100 110 120 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | | | | | | | ACTGCTCACGCCTTTGTAATAATCTTCTTTATAGTAATACCAATTATGATTGGGGGGTTTGGAAACTGGCTTGTGCCCCTCATGATTGGG T A H A F V I I F F I V I P I M I G G F G N W L V P L M I G 190 200 210 220 230 240 250 260 270 | | | | | | | | | | | | | | | | | | GCACCCGACATGGCTTTCCCCCGGATAAATAACATAAGCTTCTGGCTTCTCCCTCCCTCCTTCCTACTACTATTAGCCTCCTCTGGAGTT A P D M A F P R I N N I S F W L L P P S F L L L L A S S G V 280 290 300 310 320 330 340 350 360 | | | | | | | | | | | | | | | | | | GAAGCAGGGGCAGGAACAGGGTGGACAGTTTACCCCCCTCTTGCAGGAAACCTTGCCCACGCAGGGGCTTCTGTAGATTTAACAATCTTT E A G A G T G W T V Y P P L A G N L A H A G A S V D L T I F 370 380 390 400 410 420 430 440 450 | | | | | | | | | | | | | | | | | | TCATTGCATCTCGCAGGAGTGTCCTCCATTCTTGGGGCCATTAATTTCATTACAACCATTATTAACATGAAACCCCCAGCTATTTCACAA S L H L A G V S S I L G A I N F I T T I I N M K P P A I S Q 460 470 480 490 500 510 520 530 540 | | | | | | | | | | | | | | | | | | TACCAAACACCTTTATTTGTATGGGCCGTACTAATTACAGCAGTACTTTTACTTCTCTCCCTCCCAGTCCTGGCCGCAGGAATTACAATG Y Q T P L F V W A V L I T A V L L L L S L P V L A A G I T M 550 560 570 580 590 600 610 | | | | | | | | | | | | | | CTTCTAACGGACCGAAACCTAAATACGACCTTCTTTGACCCAGCGGGAGGAGGAGACCCAATCCTTTACCAACA L L T D R N L N T T F F D P A G G G D P I L Y Q Hình 2. Trình tự nucleotide và amino acid suy diễn đoạn gen COI mẫu nghiên cứu Bảng 1. Bảng thống kê một phần kết quả Blast đối với đoạn gen COI của mẫu nghiên cứu Độ bao phủ theo chiều dài Giá trị E Tương đồng TT Mô tả so sánh (Coverage) % (E-value) (Identity) % 1 Silurus asotus, MF805683 100 97,73 2 Silurus soldatovi, MN171302 100 97,56 3 Silurus grahami, MW217571 100 94,64 4 Silurus lithophilus, LC520058 100 94,16 5 Silurus biwaensis, LC574781 100 0,0 92,37 6 Silurus meridionalis,JX087350 100 92,05 7 Silurus glanis, KX224174 100 91,88 8 Silurus aristotelis, KJ554550 99 91,84 9 Silurus lanzhouensis, KP255959 100 90,58 Bảng 1 cho thấy, trình tự đoạn gen COI có sự tương đồng với đoạn gen COI của các loài thuộc chi cá nheo Silurus, dao động từ 90,58% - 97,73%; mẫu nghiên cứu có trình tự nucleotide đoạn gen COI tương đồng cao với COI ở loài Silurus asotus (97,73%) và Silusrus soldatovi (97,56%). Kết quả này cho phép đưa ra kết luận ban đầu là mẫu cá nheo Thái Nguyên thu được thuộc chi Silurus. Tuy nhiên, dựa trên trình tự đoạn gen COI chưa thể kết luận được mẫu cá nheo Thái Nguyên thuộc loài nào trong chi cá nheo đã được công bố và đoạn gen COI nghiên cứu không có cơ sở khoa học để định danh đến loài trong chi cá nheo Silurus. 3.3. Mối quan hệ di truyền của cá nheo nghiên cứu với các loài cá nheo chi Silurus đã công bố dựa trên trình tự đoạn gen COI Hệ số sai khác di truyền phản ánh quan hệ di truyền của cácmẫu so sánh với nhau. Hai mẫu phân tích càng gần nhau về mặt di truyền thì hệ số saikhác di truyền của chúng càng thấp và 6 Email: jst@tnu.edu.vn
5. TNU Journal of Science and Technology 226(10): 3 - 8 ngược lại. Dựa trênhân p tích, so sánh đoạn trình tự gen COI của mẫu cá nheo nghiên cứu với đoạn gen COI ở các loài cá nheo đã công bố trên Genbank bằng cách sử dụng phần mềm Bioedit, kết quả nhận được hệ số sai khác di truyền giữa các mẫu phân tích thể hiện ở bảng 2. Các mẫu phân tích trong chi Silurus có hệ số di truyền từng cặp nằm trong khoảng từ 0,023 đến 0,117, trong đó hệ số sai khác di truyền thấp nhất là 0,023 khi so sánh giữa mẫu cá nheo Việt Nam trong nghiên cứu này với loài S. asotus, hệ số sai khác cao nhất khi so sánh giữa 2 loài S. lanzhouensis và S. glanis. Bảng 2. Hệ số sai khác di truyền giữa mẫu cá nheo nghiên cứu và các loài trong chi cá nheo đã công bố Mẫu Silurus VN S.asotus S.soldatovi S.grahami S.lithophilus S.biwaens S.glanis S.aristotelis S.meridiolanis S.lanzhouensis Silurus VN 0,000 S.asotus 0,023 0,000 S.soldatovi 0,025 0,005 0.000 S.grahami 0,056 0,057 0,059 0,000 S.lithophilus 0,061 0,055 0,057 0,047 0,000 S.biwaens 0,080 0,064 0,070 0,054 0,061 0,000 S.glanis 0,086 0,088 0,093 0,084 0,082 0,093 0,000 S.aristotelis 0,086 0,080 0,082 0,068 0,068 0,071 0,091 0,000 S.meridiolanis 0,084 0,082 0,084 0,045 0,068 0,069 0,097 0,080 0,000 S.lanzhouensis 0,100 0,089 0,088 0,071 0,075 0,084 0,117 0,088 0,082 0,0000 Hệ số sai khác về di truyền còn được thể hiện ở biểu đồ quan hệ di truyền (hình 3). Hình 3 cho thấy 9 loài cá nheo và mẫu cá nheo trong nghiên cứu này được chia thành 3 nhánh. Trong đó, nhánh thứ nhất có haià lo i, đó là S. asotus và S. soldatovi. Nhánh thứ 2 bao gồm 7 loài chia thành 2 nhánh phụ: Nhánh phụ 1 chỉ có 1loài là S. glanis, nhánh phụ 2 bao gồm 6 loài: S. grahami, S. lithophilus, S. biwaens, S. glanis, S. aristotelis, S. meridiolanis và S. lanzhouensis. Nhánh 3 chỉ có 1 loài duy nhất là mẫu cá nheo Việt Nam. Do đó, có thể thấy mẫu cá nheo nghiên cứu được thu thập từ Thái Nguyên – Việt Nam có thể là 1 loài khác so với các loài đã công bố thuộc chi Silurus. Hình 3. Biểu đồ quan hệ di truyền giữa các loài cá nheo phân tích 4. Kết luận Đoạn gen COI phân lập từ mẫu cá nheo Thái Nguyên – Việt Nam có chiều dài 616bp. Mẫu cá nheo nghiên cứu được định danh thuộc chi cá nheo Silurus bằng cách sử dụng phần mềm Blast và đoạn gen COI nghiên cứu không có cơ ởs khoa học để định danh đến loài. Sử dụng phần mềm Bioedit so sánh trình tự nucleotide đoạn gen COI của mẫu nghiên cứu với các loài trong chi 7 Email: jst@tnu.edu.vn
6. TNU Journal of Science and Technology 226(10): 3 - 8 Silurus đã công bố trên Genbank cho thấy mẫu cá nheo nghiên cứu có thể là 1 loài khác so với các loài đã công bố trong chi cá nheo Silurus. TÀI LIỆU THAM KHẢO/ REFERENCES [1] J. A. Castro, A. Picornell, and M. Ramon, "Mitochondrial DNA: a tool for populational genetics studies," Int Microbiol, vol. 1, no. 4, pp. 327-332, 1998. [2] A. K. Singh, R. Kumar, M. Singh, A. K. Mishra, U. K. Chauhan, V. S. Baisvar, R. Verma, N. S. Nagpure, and B. Kushwaha, "Mitochondrial 16S rRNA gene-based evolutionary divergence and molecular phylogeny of Barilius spp," Mitochondrial DNA, vol. 26, no. 1, pp. 41-47, 2015. [3] K. Tamura, G. Stecher, D. Peterson, A. Filipski, and S. Kumar, "MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0," Mol Biol Evol, vol. 30, no. 12, pp. 2725-2729, 2013. [4] S. R. Zhu, J. J. Fu, Q. Wang, and J. L. Li, "Identification of Channa species using the partial cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene as a DNA barcoding marker," Biochemical Systematics and Ecology, vol. 51, pp. 117-122, 2013. [5] Fishbase, "Silurus", 2020. [Online]. Available: [Accessed Feb. 22, 2021]. [6] Q. R. Wang, Z. Q. Wei, and P. Y. Song, "Genetic Diversity of Silurus asotus on Mitochondrial DNA 16S rRNA gene partical sequence," Journal of Animal and Veterinary Advances, vol. 11, no. 11, pp. 1843-1846, 2012. [7] V. H. Nguyen, T. H. N. Vu, and T. D. P. Nguyen, "Three Fish Species of The Genus Silurus Linnaeus, 1758, (Siluridae, Siluriformes) Newly Discovered in Northern Vietnam," J. Sci. &Devel., vol. 13, no. 1, pp. 65-74, 2015. 8 Email: jst@tnu.edu.vn